Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

超好熱菌 / 始原菌 / アーキア / ゲノム / 超好熱性 / 遺伝子破壊

超好熱菌(hyperthermophile)は90℃以上でも生育可能な微生物であるが、生物がなぜこのような高温環境で生育し増殖できるのかという命題は極めて興味深い。これまでにタンパクの高い熱安定性、エーテル脂質・tRNAの特異修飾などが指摘されているが、実際には数多くの要因からなる相加的・相乗的な効果により超好熱性が達成されているものと推測される。本研究では我々が独自にゲノム解析した超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1株を研究対象とし、高温感受性株の解析などから超好熱性を付与する遺伝子を多数同定することを目指す。
T. Kodakaraensisの利点は形質転換手法が確立されており、遺伝学的手法を駆使できることである。上述の高温感受性株の単離のために、まず超好熱菌ではこれまで例のないトランスポゾンによるランダム変異ライブラリーの作製を試みた。挿入配列による変異頻度が高いことが知られている好酸好熱菌Sulfolobus solfataricusおよび複合型トランスポゾンが挿入されている超好熱菌P. furiosusからtransposase遺伝子のクローニングおよびT. kodakaraensisにおけるトランスポゾン変異を試みているが、現在までにトランスポゾンの転移は確認できていない。今後、transposase遺伝子を強制発現させるプロモーター領域の導入やtransposaseが認識する反復配列、ベクターのデザインについて検討を加える。
一方、T. kodakaraensisを含む超好熱菌にのみ存在し、常温生物や好熱菌には存在しない遺伝子として染色体DNAのポジティブコイル形成を促進するreverse gyrase (Rgy)が知られている。そこでT. kodakaraensisのrgy遺伝子の破壊を試みたところ、破壊株を取得することができた。さらにrgy破壊株は80℃以上の高温において顕著に比増殖速度が低下し、野生株が生育可能な93℃では増殖しなかった。これらの結果はrgyが超好熱性の発現に重要な遺伝子であるものの、90℃までの環境では必須ではないことを示している。これは生命がどのような環境で生まれたかを考察する上でも興味深い結果と言える。

超好熱菌 / 始原菌 / アーキア / ゲノム / Missing gene / 機能未知遺伝子 / 遺伝子破壊 / トランスポゾン

90℃以上でも生育可能な超好熱菌においては生育に必須な機構や代謝を構成する遺伝子群がそのゲノム中に見いだされても、その一部は相同性解析から全く同定できない"missing gene"となっているケースが多い。本研究では、T.kodakaraensisのゲノム情報と遺伝子操作技術により本菌の2.09Mbpゲノム上に散在する"missing gene"の同定と機能検証を進めた。
昨年度までに引き続き、超好熱菌ではこれまで例のないトランスポゾンによるランダム変異法の確立を試みた。好酸好熱菌S.solfataricusのトランスポゾン転移株から単離したトランスポザーゼ(TPase)遺伝子、および近縁のP.furiosusの推定TPase遺伝子を種々のプロモーター領域の下流に配置したトランスポゾンベクターを新たに作製した。これらを用いてT.kodakaraensisトリプトファン要求性株におけるtrpEマーカ0の転移を試みたが、明確なトランスポゾンによる転移の確認はできなかった。今後はTPase遺伝子の発現の確認や、in vitroでの転移活性の確認を行い、最終的に超好熱菌におけるトランスポゾン変異の確立を目指す。
一方、T.kodakaraensis有機酸代謝経路において"missing gene"であるスクシニル-CoAシンテターゼ(SCS)が、アセチル-CoAシンテターゼI(ACSI)およびACS IIのパラログであることを見出した。特にSCSとACS IIは共通のスモールサブユニットに異なるラージサブユニットが会合することにより異なる基質特異性と機能を実現していることを明らかにした。また通常は糖新生酵素であるホスホエノールピルビン酸シンターゼが超好熱菌の解糖系において必須であることを遺伝子破壊により証明した。

超好熱菌 / 機能未知遺伝子 / 遺伝子破壊 / 始原菌 / 新規代謝系 / ゲノム / Thermococcus / 比較ゲノム / ゲノム科学 / 遺伝子機能解明 / DNA chip / proteome

1.超好熱菌遺伝子破壊系の改良
ΔpyrF株を宿主とし、pyrFマーカー遺伝子の上流および下流に相同領域を導入することにより、一段階目の相同組換えの後にpyrFマーカー遺伝子がゲノム上から脱落する系を開発した。この系では原理的には如何なる数の遺伝子でも破壊・導入が可能となる。
2.中央代謝経路の解明
炭素中央代謝に着目し、ゲノム情報からその存在が不明であった多数の遺伝子を特定した。
(1)我々は超好熱菌ゲノム上でそれまで特定されていなかった糖新生経路の鍵酵素はfructose 1,6-bisphosphatase(FBPase)遺伝子を同定し、遺伝学的にその機能も証明した。
(2)本菌の解糖系の最終反応が一般的なpyruvate kinaseではなく、phosphoenol-pyruvate synthaseにより触媒されていることを遺伝学的に証明した。
(3)今まで知られていた経路と異なる構造的に新規な3種の酵素から構成される新しいキチン分解経路を発見した。
(4)T.kodakaraensisではribulose monophosphaIe pathwayの逆反応がpentose合成を担っていることを発見し、従来のpentose phosphate pathwayに代わる始原菌特異的なpentose合成経路を明らかにした。
以上の研究成果によりT.kodakaraensis K0D1の中央炭素代謝のほぼ全容が明らかとなった。
3.Reverse gyrase paradoxの解決
Reverse gyraseは唯一の超好熱菌固有の酵素である。Reverse gyraseの特徴的な構造と本酵素が超好熱菌の生育に必須であると考「えられてきたことから、生命が超好熱菌として誕生したという説は否定されていた。我々はreverse gyrase遺伝子の破壊株を取得することに成功し、破壊株が90℃で生育することを見いだした。したがって、reverse gyraseが存在しない条件であっても生命が高温環境(90℃)で誕生し得たことを実験的に証明した。
4.Type III Rubiscoの機能解明
Type III RubiscoはCalvin回路を持たないArchacaにのみ存在し、Rubiscoのcarboxylase活性を示すものの、その生理的役割は不明であった。我々は比較ゲノム的アプローチよりT.kodakaraensis内でAMPからType III Rubiscoの基質ribulose1,5-bisphosphateを供給できる2種の新規酵素AMP phosphorylaseおよびribose 1,5-bisphosphate isomeraseを同定した。この代謝経路は糖新生系の一部とpentose phosphate pathwayの一部と合わせて新しい第5の炭酸固定経路を形成し得ることも判明した。

【研究分担者】
金井保	京都大学	工学研究科	助手	(Kakenデータベース)
跡見晴幸	京都大学	工学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
福居俊昭	京都大学	工学研究科	助手	(Kakenデータベース)