【研究領域課題番号】20K08100 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

MAP3Ks / カルシウム / カルパイン / ハイパーサーミア / 放射線増感 / 放射線 / 温熱 / MAPK / MAP3K / TAK1 / MEKK2 / イメージング / プロテオミクス

【研究成果の概要】

本研究は、放射線増感に直結する原因タンパク質を生化学的アプローチにより同定し、放射線あるいは他の療法との併用による抗腫瘍効果における真の標的を明らかにするとともに創薬に向けた土台を構築することを目的とする。正常細胞と様々な癌組織由来の培養細胞を用いて、エックス線や温熱などの単独あるいは併用時によるタンパク質の挙動について二次元電気泳動および質量分析装置を使用したプロテオーム解析を実施した。その結果、温熱処理特異的に発現量が低下する因子としてMAPKキナーゼカスケードを構成し、MAP3KメンバーであるMEKK2、RAF1、TAK1を同定した。面白いことにエックス線照射ではこれらのMAP3Kメンバーの発現低下は認められず、また温熱処理時に他のMAPKカスケード構成因子MAP2KであるMEK5、MKK4やMAPKに属するJNK、ERK1/2などにも発現変化は認められなかった。これら温熱特異的なMAP3Kの発現低下のうち、MEKK2とTAK1についてはタンパク質分解酵素の阻害剤であるALLNやCalpeptinなどによって抑制されたことから、タンパク質分解経路による翻訳後修飾によるものであることが判明した。一方、RAF1に関しては、RT-PCR解析により遺伝子発現レベルでの低下とあることが推測された。さらにカルシウムイオノフォアA23187による影響を解析した結果、MEKK2、TAK1の分解が見られ、それらの分解はカルパイン阻害剤で抑制された。これらのことから温熱特異的なMAP3Kの発現低下はカルシウム経路によるタンパク質分解系が関与していることが示唆された。さらにMEKK2, TAK1, RAF1の発現をsiRNAにより抑制したところ、細胞増殖やコロニー形成能が顕著に抑制された。以上の結果より、温熱によるMAP3Ksの発現低下は細胞増殖の抑制に寄与することが判明した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】16K07316 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カルシウムイメージング / カルシウムシグナル / 細胞 / アストロサイト / カルシウムチャネル / 新規カルシウムセンサー / 高感度 / 高解像度 / カルシウム / 神経細胞 / グリア細胞 / イメージング / プローブ開発 / マルチカラーイメージング / AMPA受容体 / 遺伝子コード型カルシウムセンサー / 神経 / シナプス可塑性

【研究成果の概要】

生物はCa2+を伝達物質として用いて、多様な生理機能の誘導を可能にしている。しかし、Ca2+がどのように多様な情報をエンコードしているかについては、未解明の点が多い。我々は、「local Ca2+センサー」を作成し、従来法では判別できなかったCa2+シグナルの由来を特定し、Ca2+シグナルの多様性を記述するためのlocal Ca2+センサーを開発した。このlocal Ca2+センサーを利用して脳の制御を担うグリア細胞アストロサイトの自発的Ca2+シグナルを解析し、海馬アストロサイトのCa2+恒常性を維持するメカニズムを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】食生活学

【研究領域課題番号】15K12322 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

味覚 / イメージング / カルシウム / 細胞応答

【研究成果の概要】

本申請研究では、味覚受容機構解明の基盤となり、また、様々な味物質・非味物質で構成される食品の味の総合的な評価を実現する解析系の構築を目指したものである。
Ca2+感受性蛍光タンパク質遺伝子を味蕾細胞に発現する複数系統の動物の作製に成功した。これらの動物を用いて、遺伝子導入によって味蕾細胞に発現したCa2+感受性蛍光タンパク質の蛍光観察による味蕾細胞の味刺激応答のイメージングを試みた。結果として、基本味の1つを呈する味溶液の刺激によって、わずかであるが有意に味蕾細胞における蛍光の変化を観察することが出来た。つまり、味刺激に対する味蕾細胞の応答を観察できた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】神経生理学・神経科学一般

【研究領域課題番号】26250003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経線維 / 樹状突起 / 軸索 / カルシウム / スパイン / 脳・神経 / 神経細胞 / イメージング / 神経科学

【研究成果の概要】

光学測定系を工夫・改善し、300個以上のシナプスから100 Hzという高速での撮影を可能にした。この革新的な新技術を用いて、
i）海馬CA3野樹状突起の回路演算様式を解析した結果、興奮性入力と抑制性入力のバランスが線維の局所では崩れていることを見出した。この結果はCell Report誌で発表した。
ii）経験によって一度活動したCA1野神経細胞は、上流のCA3野からの精密な軸索回路による特異的入力によって再活性化すること、また樹状突起イメージングを行うことで、この再活動そのものを繰り返すことによって再活性化する細胞セットの精度が高まることを発見した。この結果はScience誌に報告した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2018-03-31

【配分額】39,910千円 (直接経費: 30,700千円、間接経費: 9,210千円)

【研究分野】神経・筋肉生理学

【研究領域課題番号】23800019 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経科学 / 脳・神経 / 神経 / ニューロン / シナプス / スパイン / 樹状突起 / 回路 / イメージング / カルシウム

【研究成果の概要】

新規に開発した大規模スパインイメージング法を用いて、海馬ニューロンの樹状突起におけるシナプス入力の時空間パターンを観察することに成功した。興奮性ニューロンにおいては近傍のスパインが同時に活動していたことから、同期入力が樹状突起の局所に集約されていることが見いだされた。一方で、Parvalbumin陽性の抑制性ニューロンにおいては同期入力が分散型であることを見いだし、ニューロン種特異的なシナプス入力の空間制御が存在することを明らかにした。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2011

【配分額】1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】21700374 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マイネルト基底核 / アセチルコリン / 大脳皮質 / 長期増強 / グリア細胞 / イメージング / in vivo / 2光子顕微鏡 / 皮質可塑性 / カルシウム / イン・ビボ / カルシウム計測 / マウス / シナプス可塑性

【研究成果の概要】

麻酔下マウスのマイネルト基底核(NBM)とヒゲ刺激とを同時に行って大脳皮質において長期増強(LTP)を誘導し、その間の大脳皮質細胞群カルシウム(Ca^<2+>)活動を二次元可視化解析した。この結果LTP誘導最中にグリア細胞がCa^<2+>活動していることを発見した。さらに、このCa^<2+>活動を抑制したところ、NBM刺激に対する神経細胞応答は正常にも関わらず、LTPが消失することを発見した。これらの結果は、LTP誘導にグリア細胞活動が必須であることを生きたままの動物で初めて示した点で重要である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】薬理学一般

【研究領域課題番号】20790205 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血管内皮細胞 / カルシウム / ストア作動性カルシウム流入 / von willebrand factor(vWF) / 血管新生 / イメージング / チューブ形成

【研究成果の概要】

血管新生プロセスでは血管内皮細胞内のカルシウム動態が重要な意義を有していると考えられているが、血管内皮細胞へのカルシウム動員機構については不明な点が多い。本研究では、免疫細胞等でストア作動性カルシウム流入(SCOCE)に重要であると提唱されているStim1とOrai1が、血管内皮細胞においてもSCOCの制御に重要であることを明らかにした。また、VEGF刺激時に血管内皮細胞からのvon willebrand factorの放出がSOCE活性依存的に制御されていることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】19700306 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

in vivo / イメージング / 大脳皮質 / アセチルコリン / カルシウム / 2光子顕微鏡 / マイネルト基底核 / 覚醒 / 光子顕微鏡 / イン・ビボ / カルシウム計測 / ラット

【研究成果の概要】

マイネルト基底核などの皮質下神経核は大脳皮質へ作用して、睡眠-覚醒を制御する。従来の研究の観測対象は大脳皮質の脳波や血流、アセチルコリン放出量であった。そのため、マイネルト基底核が大脳皮質のグリア細胞へ与える作用はほとんど知られていない。本研究はin vivo2光子顕微鏡を用いることで、生きた動物個体の大脳皮質に存在する神経細胞のみならずグリア細胞の活動も計測した。その結果、マイネルト基底核の活動が、大脳皮質神経細胞だけでなく、グリア細胞の細胞内カルシウム濃度も上昇させることを発見した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,750千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 450千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】19659013 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イメージング / in vivo / 血管 / 海馬 / カルシウム / 神経回路

【研究成果の概要】

多ニューロン活動のカルシウム画像法は次世代ツールとして注目されているが、しかしながら、現時点では、脳スライス標本において成功を収めていたに過ぎなかった。そこで、本研究では、この新技法を個体動物の脳に応用し、生きた動物でニューロン活動を記録することに挑戦した。しかも、大脳皮質のような脳の表層部位ではなく、脳の深部での観測法を確立を試みた。とりわけ従来はまったく不可能であった海馬からの記録に挑戦した。最終年度である20年は、特別設計された尖端状の極細対物レンズを用いることで、実際に、脳深部からのイメージングが可能であることを証明した。具体的な実験としては、血管造影剤FITC dextranを静脈内投与し、血流速と血液細胞数を同時に観察した。
脳のエネルギー代謝における恒常性は、脳への安定した血流供給により維持されている。たとえば、脳には急激な血圧変化に対しても、脳血流を一定に保つような機構が働く。これは自動調節能と呼ばれ、古くから知られている。しかし、海馬のような脳深部から1本1本の毛細血管の解像度で自動調節能を観察した研究は過去になく、本研究で新たに開発したスティック型の細径対物レンズがこれを可能とした。
薬理学的に血圧を一過性に変化させ、海馬と末梢組織の毛細血管で血流速度変化を比較し、脳実質内血管における自動調節能の存在を確認した。一方、その速度変化は個々の血管で様々であったことから、自動調節能とは脳全体での調節だけではなく、個々の血管レベル、すなわち局所的な調節も関与することが本研究より初めて明らかとなった。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】17689004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イメージング / カルシウム / 神経回路 / 海馬 / カルシウム画像化 / シナプス可塑性

【研究成果の概要】

ニポウ板の回転数を高めることで世界最高の超高速fMCIに成功した。現在の最高到達点は2000 Hzであるが、しかし、実用的には500Hzで撮影するのが無難であるように思われる。スパイク高速自動検出方法を確立した。これによってスパイク抽出過程における人為的なミスを大幅に減らすことができた。現在、学術論文としてまとめている。マウス急性スライス標本でカルシウム色素の負荷率の部位差を詳細に検討し、こちらも現在、学術論文としてまとめている。
以上で達成した超高速イメージングを用いて、海馬CA3野の自発活動の内部構造の解析を行った。安定した画像取得を得るため毎秒500フレームの画像取得に留めた。すなわち2 msの時間分解能で活動を捉えた。自発活動に潜む同期活動に着目し、同期ペア数を数えた。この数値を慎重に設定した2種のSurrogateデータと比較することで、同期活動は10 ms以下の高い時間精度をもっていることが明らかになった。ダイナミッククランプを用いることで、この時間精度は、ベキ分布的に同期した入力によって発現されていることを突き止めた。
また特筆すべき事項として、i)オリンパス株式会社バイオ開発2部との共同研究「スティック対物レンズを用いた小動物の脳深部観察の実現」を開始した、ii)RIKEN BSIの深井朋樹ラボと「海馬回路モデル構築」の共同研究を開始した、iii)オセルタミフルのシステム薬理学研究に関して、東京大学・大学院薬学系研究科の柴崎正勝教授および福山透教授との共同研究を行った、などがある。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】30,420千円 (直接経費: 23,400千円、間接経費: 7,020千円)

【研究分野】神経・筋肉生理学

【研究領域課題番号】15700309 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

中枢神経細胞 / 神経生理学 / 超短パルスレーザー / ケイジド試薬 / グルタミン酸 / 受容体 / 生理学 / 2光子励起顕微鏡 / スパイン / 高性能レーザー / カルシウム / イメージング

【研究成果の概要】

これまでケイジドグルタミン酸を2光子励起法で活性化する手法により、海馬錐体細胞において、機能的AMPA受容体発現とスパイン形態に強い相関があることを見出してきた。そこで本研究において、可塑性に重要な役割を果たすNMDA受容体の機能と、スパイン形態との間の関係性を調べることを行った。実験方法としては、海馬錐体細胞にホールセルを行い、低親和性カルシウム指示薬と、細胞形態を同定するためのAlexa594をロードした。これはカルシウム指示薬によるカルシウム動態の影響を少なくするためである。細胞外液のマグネシウム濃度を減らした状態で、任意のスパイン部位に対して、2光子励起によってケイジドグルタミン酸を活性化した。その結果誘発される単一スパインにおけるNMDA受容体を介したカルシウム濃度上昇を、2光子励起顕微鏡を用いて、高速ラインスキャンを行ってイメージングした。Alxa594の蛍光に対するカルシウム指示薬の蛍光比によってカルシウム濃度変化を捉えた。この方法によって、一定刺激の条件でのスパイン内カルシウム濃度変化の絶対値を求めることができるようになった。カルシウム濃度上昇は、レーザー出力の2乗に比例し、あるところで飽和することから、スパイン頭部のNMDA受容体を2光子励起法によるグルタミン酸投与によって刺激できることを実証した。また1.5マイクロメートル以上離れたスパイン間では互いに刺激が干渉せず、個々のスパインだけの反応を得られることがわかった。NMDA受容体電流及びカルシウム濃度上昇は、AMPA受容体に比べ、ノイズが高いため、同一スパインにおいて3回刺激し、それを平均化することでCVの低い値を得ることができた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】動物生理・代謝

【研究領域課題番号】12440237 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプチドニューロン / 開口放出 / 神経修飾 / 分子生理学 / カルシウム / 神経生理学 / パッチクランプ / GnRH / イメージング

【研究成果の概要】

本研究では、脊椎動物においてGnRHニューロンの解析に最も適した実験系の一つである淡水産熱帯魚ドワーフグーラミーの脳を用い,まず脳・下垂体スライス標本から培養液中へのGnRH放出をラジオイムノアッセイ(RIA)で測定し、視索前野と終神経という異なるGnRH系の分泌活動の違いやそれらの機構を明らかにした。また,視索前野GnRH系においてGnRH放出の顕著な雌雄差を見出し,それがsbGnRHという分子種のGnRHペプチドを産生するニューロンの雌雄差によることを発見した。次に,微小炭素繊維電極を作製してGnRHを電気化学的に測定する方法を開発し、この方法を用いて、脳・下垂体スライスにおける視索前野GnRHニューロン軸索終末領域から、ホルモン分泌活動のリアルタイム記録を行った。また、GnRH放出に関与すると考えられるイオンチャネルなどの検索を行った。次に,GnRH放出に重要であるGnRHニューロンのペースメーカー活動の生成と,神経伝達・修飾物質によるその修飾のメカニズムについて電気生理学的に解析した。その結果,GnRHペプチド自体による終神経GnRHニューロンのペースメーカーの修飾にはNおよびR型のカルシウムチャネルが関与していることが強く示唆された。また,終神経GnRHニューロンへの興奮性シナプス入力としてグルタミン酸が候補に上がったので,このグルタミン酸受容体の同定を試みた。各種のアゴニスト・アンタゴニストを用いた実験の結果、既知のグルタミン酸受容体に加え、これまでにない新しい薬理学的性質を持ったグルタミン酸受容体があることを発見した。本研究の結果は、脊椎動物中枢神経系のペプチド神経修飾系の一般的な性質を理解する上で貴重な常法を提供すると考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】13,200千円 (直接経費: 13,200千円)