Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

DNA / GFP / PCR / キャピラリー電気泳動 / タンパク質 / プロテオミクス / 翻訳 / 遺伝情報発見 / 蛍光蛋白質 / プライマー / 分子システム / 増幅反応 / 論理ゲート / 論理判断 / RNA / アミノ酸 / 蛋白質 / 転写 / 遺伝子 / 遺伝子工学 / マイクロ流体チップ / 蛍光イメージング / キャピラリ-電気泳動

酵素的なDNA 増幅反応と,増幅されたDNAをオンチップ電気泳動で分離する手段を組み合わせることにより,遺伝情報の発現に必要な配列をコードしたDNAの組換え,組み替えられた目的DNAの選別,DNAからmRNAへの転写,mRNAからタンパク質への翻訳,翻訳されたタンパク質の検出までの一連の流れを,細胞の助けを借りることなく達成する手法を開発した.

水の安全 / 病原微生物 / ウイルス / 遺伝子 / 指標微生物 / 紫外線 / 銀 / 消毒 / 上水道 / ミクロキスティン / レジオネラ / 大腸菌 / PCR / 安全性 / 光回復 / RNA

総合的な病原微生物対策のために必要ではあるが未解決の課題群に取り組み、以下の成果を上げた。
紫外線照射により不活化した大腸菌の海水中での挙動を解明するため、NaCl 溶液、MgCl2溶液、CaCl2 溶液中における光回復の程度を調べた。その結果、全ての溶液中で、高い塩濃度では光回復が抑制された。光回復抑制の機構は、細胞膜内外における陽イオンの電位差が浸透圧を生み出し、光回復酵素の生成が阻害されたからだと考えられる。
紫外線消毒の効率を上げるための試みとして、銀の併用によるウイルスの不活化効果の測定を行った。銀イオン0.05ppm 存在下における低圧紫外線による不活化では、大腸菌およびファージQβは銀存在下で不活化速度が大きくなり紫外線と銀の相乗効果が見られるが、ポリオウイルスおよびマウスノロウイルスに対しては銀の影響は見られなかった。
湖沼等において発生する藍藻類の異常増殖を抑制する新たな手法としての中圧及び低圧の紫外線照射処理において、藍藻類が生産する毒素ミクロキスティンの放出に関する研究を行った。その結果、紫外線照射によって藻類が破壊される影響よりも藻類が減少する影響が卓越し、水中のミクロキスティン濃度の上昇が抑制されることを見出した。
水道の給配水管路等において形成される生物膜などで増殖するレジオネラ属菌およびシュードモナス属菌に対して、銀を用いた消毒を試みた。その結果、菌体あたりに吸着する銀の量をパラメータとすることで消毒効果を定式化することが可能であることを見出した。
ウイルス粒子の選択的な濃縮を行う手法としてMgを用いる方法が適していることが分かった。また、ノロウイルスの塩素消毒耐性は他の腸管系ウイルスと同等以下であり、十分な塩素消毒が施された配水システムにおいてはノロウイルスが感染力を保ったまま末端給水栓まで到達する可能性は低いことが示唆された。

プリオン / マウス / ジーンターゲッティング / 遺伝子 / アポトーシス / プロモーター / アデノウイルス / PCR

白オリックスプリオン遺伝子に特異的なプライマーを使ったPCR法によりオリックスプリオン蛋白質翻訳領域を含むDNA断片を増幅し、TA-cloning vectorにサブクローニングした。オリックスプリオン蛋白質を過剰発現するマウス作成のため、外来遺伝子の全身での発現を強力に誘導するβ-アクチンプロモーターの支配下にオリックスプリオンcDNAを組み込んだ(pActin-oPrp)(図参照)。得られるトランジェニックマウスでは脳、免疫細胞、筋肉などを含むすべての臓器で外来遺伝子の発現が期待される。実際に我々は既にCT2(分泌蛋白)を同β-アクチンプロモーターの支配下に組み込んだトランジェニクマウスを作成し、すべての臓器におけるCT2の発現をノーザンブロット法により確認し、さらにCT2モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によりトランスジェニクマウス血清中におけるCT2蛋白質の存在を確認している。完成したプラスミッド(pActin-oPrp)は制限酵素Sal IおよびHind IIIで処理され、ベクター配列が除かれた後、Gene clean kitを用いて精製された。現在、得られたトランスジーン断片をアイクロインジェクション法によって、BDF1マウスの受精卵に導入している。20日後には仔が生まれ、さらに4週後には成熟したマウスの尾よりDNAを回収し外来遺伝子の存在を確認する予定である。

IL-8 / 間質性肺疾患 / 肺胞マクロファージ / フローサイトメトリー / 遺伝子 / PCR / 過敏性肺臓炎 / 特発性肺線維症

我々は、平成5年度科研費により以下の成果を得た。
1.サンドイッチELISA法による間質性肺疾患患者の肺胞洗浄液(BALF)中IL-8定量:
各種間質性肺疾患群の中では、対照と比較して過敏性肺臓炎でBALF中IL-8が有意に高値を示した。またBALF好中球分画率がBALF中IL-8値と相関した。特発性肺線維症に関しては、BALF中IL-8が高値を取らず、欧米の結果と相いれなかったが、これは当研究の対象症例が安定期にあったためと考えた。一方、試験管内で肺胞マクロファージ、単球、好中球、培養血管内皮細胞、培養上皮細胞を細菌内毒素で刺激し、各々のIL-8産生量を検討したところ、肺胞マクロファージ、単球・血管内皮細胞で多く、特に肺胞腔内では肺胞マクロファージのIL-8産生への関与が大きいと考えられた。
2.フローサイトメトリーによるBALF細胞内IL-8検出:
対照例より得られたBALF中細胞を種々の方法で処理し、細胞内IL-8の検出を試みた。その結果、PFA固定/サポニン処理により、安定して検出することが可能となった。また細菌内毒素で刺激した種々のBALF細胞の中では、特に肺胞マクロファージにおいて細胞内IL-8の増加が検出された。今後、間質性肺疾患患者より採取したBALF細胞につき検討予定である。
3.IL-8遺伝子検出法の確立;
まず簡易RNA抽出法で得た総RNAよりoligodTプライマーを用いてcDNAを合成し、さらに一対の合成オリゴ・プライマーを用いてPCR法に増幅し電気泳動ゲル上で検出する方法を確立し、その定量性につき現在検討中である。

【研究連携者】
藤井輝夫	東京大学	生産技術研究所	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
滝沢智	東京大学	大学院・工学系研究科	教授	(Kakenデータベース)
佐藤弘泰	東京大学	大学院・新領域創成科学研究科	准教授	(Kakenデータベース)
片山浩之	東京大学	大学院・工学系研究科	准教授	(Kakenデータベース)
小熊久美子	東京大学	大学院・工学系研究科	講師	(Kakenデータベース)

【研究連携者】
滝沢智	東京大学	大学院・工学系研究科	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
松本安喜	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
松本芳嗣	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
百渓英一	農林水産省	家畜衛生試験場	室長