【研究分野】統合動物科学

【研究領域課題番号】15K07778 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

精子形成 / 不妊 / マウス / 受精能獲得 / Slc22a14 / Dlec1 / SLCトランスポーター / 精子 / アンドロロジー / 生殖細胞 / ノックアウトマウス / ゲノム編集 / ノックアウト

【研究成果の概要】

我々は，Slc22a14とDlec1の発現様式や生理的機能についてマウスを用いて解析し，これらの遺伝子が雄の生殖能に極めて重要な遺伝子であることを見出した。例えばSlc22a14は精巣特異的かつ生殖細胞特異的に発現しており，この遺伝子を欠損すると精子の運動能・受精能が低下し，雄マウスの生殖能力が著しく低下する。また，Dlec1を欠損したマウスでは，精子分化に異常があるため，正常な精子がほとんど産生されず完全な不妊となる。Slc22a14やDlec1はヒトにも保存されていることから，これら遺伝子は潜在的なヒト男性不妊原因遺伝子であることが示唆される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】18700394 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ウイルス / 感染防御 / マウス / インターフェロン / 発生工学 / ノックアウトマウス / オリゴアデニル酸 / ウイルス感染 / 炎症性疾患

【研究成果の概要】

代表的なインターフェロン(IFN)誘導遺伝子の一つである2',5'-オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)は、「2-5Aシステム」と呼ばれるIFNによるウイルス感染防御機構を担っていることが古くから知られていたが、それ以外のOASの機能についてはほとんど研究がなされていなかった。そこで我々は、マウスOAS遺伝子のクローニングおよび解析を行い、さらにOASの生理機能を明らかにする目的でこれまでに5種類のOASファミリー遺伝子欠損(Oas1a^<-/->, Oas1c^<-/->, Oas2^<-/->, Oas1a/Oas2^<-/->, Oas1/Oas2/Oas3 (OASC)^<-/->)マウスの樹立に成功している。本研究ではこれらのマウスを用いて表現型の解析を行なったところ、ファミリー遺伝子の中でOas1aは特徴的に(1)細胞内ウイルス認識において下流実行因子RNaseLとは共役しない新規機能を持ち、(2)炎症応答時においてはサイトカインのシグナルを負に調節するが、STAT1のリン酸化シグナルには直接関与せず未知の機構を介していること、が示唆された。また、OAS遺伝子は卵巣で構成的に非常に強く発現しているものの、OAS遺伝子クラスターを欠損するOASC^<-/->マウスにおいても産仔数等に異常は認められないことから、(3)OASは通常飼育条件下では卵子発達に特に必須ではないことが明らかになった。これらのことから、Oas1aが特異的に「2-5Aシステム」の概念から逸脱する新機能を持つことが明らかになり、OASファミリー遺伝子欠損マウスを用いた更なる解析が必要であると考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】17390140 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自己免疫 / サイトカイン / 関節リウマチ / 疾患モデル動物 / 樹状細胞 / 炎症性疾患 / 自然免疫 / C型レクチン / マウス / 発生工学 / 自己免疫疾患 / マイクロアレイ / ノックアウトマウス / トランスジェニックマウス

【研究成果の概要】

我々はHTLV-I TgマウスとIL-1Ra KOマウスの2種類の関節リウマチモデルを独自に開発し、その発症構の解析を行って来た。マイクロアレイによる発症関連遺伝子の網羅的解析の結果、樹状細胞やマクロファージで発現するC型レクチンファミリーに属する遺伝子が2種類のモデルマウスの関節局所で発現亢進していることを見いだした。本研究ではそれらのC型レクチンのノックアウト(KO)マウスを作製し、これらの遺伝子の、1.樹状細胞の分化・増殖における役割、2.抗原提示能におよぼす影響、3.関節炎発症における役割、を明らかにすることを目的とした。
現在までにこのC型レクチンファミリーに属する遺伝子のうち、3種類のKOマウスを作製した。そのうち、Dectin-1はβグルカンのレセプターであり、サイトカイン産生と活性酸素種(ROS)を同時に産生することを明らかにした。また、病原性真菌であるP.cariniiの感染防御に重要な役割を果たしていることを示した。また、DCIRは細胞内に抑制性モチーフであるITIMを有するが、機能は不明であった。このDCIR KOマウスを作製したところ、自己免疫性の唾液腺炎や関節炎を自然発症する事を見いだした。In vitroでは、骨髄由来樹状細胞(BMDC)が野生型マウスに比較しより増殖していた。この時、GMCSF受容体の下流のシグナルを伝えるSTAT5のリン酸化が亢進していた。さらにDCIR KOマウスはコラーゲン誘導関節炎に対する感受性も亢進しており、発症率が高くなっていた。このことから、DCIRは関節炎治療薬の標的となる可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】15,550千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】神経・筋肉生理学

【研究領域課題番号】11680814 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経伝達アミノ酸 / セリンプロテアーゼ / 前初期遺伝子 / 感受性期 / 暗闇飼育 / 眼優位可塑性 / 大脳皮質第一次視覚野 / 遺伝子欠失変異マウス / パルブアルブミン / プラスミノーゲンアクチベーター / 単眼遮蔽 / 第一次視覚野 / グルタミン酸脱炭酸酵素 / 単一神経細胞外記録 / ノックアウトマウス / 短期抑制 / 神経興奮伝播 / マウス

【研究成果の概要】

1.マス大脳皮質第一次視覚野(VC)のシナプス可塑性に対する暗闇飼育(DR)の影響
DRにより視体験を完全に欠いたマウスVCの生後発達を、1)神経細胞記録法を用いた両眼性細胞領域(BZ)の眼優位性、2)高速液体クロマトグラフィーを用いた神経伝達アミノ酸解析、および3)免疫組織化学法を用いた抑制性介在ニューロンの動態から調べた。その結果、DRでは眼優位可塑性レベルは維持されておりDR後数日間の視体験で単眼遮蔽の効果が認められること、グルタミン酸およびGABAのVC内の含有量はDRでも正常であるにも関わらず、抑制性介在ニューロンのサブタイプ(大型のパルブアルブミン陽性細胞)においてその発達に異常があることが明らかとなった.本研究は、マウスの第一次視覚野におけるDR効果を種々の側面から明らかにした初めての報告である.
2.シナプス可塑性候補遺伝子群の探索
興奮・抑制入力のバランスが損なわれ可塑性レベルが低下したグルタミン酸脱炭酸酵素(GAD65)遺伝子欠損変異体(KO)において神経活動に依存して変動する前初期遺伝子であるegr-1の発現の異常が認められたことから、初めに可塑性関連候補遺伝子としてこの遺伝子に注目した.しかし、神経細胞記録からegr-1のKOの眼優位可塑性レベルは正常であることがわかった.そこで、GABAの下流にある可能性が高く、もう一つの可塑性低下モデルである組織型プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)KOを用い、BZに関しプロテオーム解析を行った.2次元電気泳動の結果、野生型とtPA KOで明らかにパターンの異なるスポットを見いだした.
質量解析の結果、この蛋白はアネキシンVIであることが明らかとなった.本研究は最終年度を迎えたが、今後もこの蛋白が視覚野可塑性に関与するか否か検討を続けていきたい.

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】10670193 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

K-ras / H-ras / N-ras / 標的遺伝子置換 / ES細胞 / ジーンターゲッティング / ノックアウトマウス / マウス

【研究成果の概要】

本研究は、Rasタンパク質の個体での生理機能を知るため、H-ras、N-ras、K-ras遺伝子欠損マウスの作成を目的とした。その結果、H-ras欠損マウスとN-ras欠損マウスが正常に発生、成長するのに対して、K-ras欠損マウスは心臓の形成不全による胎生致死となり、心筋細胞の増殖にK-Rasが必須であることが分かった。また、H-RasがNMDA受容体のチロシンリン酸化の制御を介して海馬CA1でのNMDAシナプス伝達、さらにLTPの調節を行っていることを明らかにしてきた。これらの事実から、各種臓器において3つのRasタンパク質に役割の違いがあることが分かった。しかし、さらに各ras遺伝子欠損マウス同士を交配し、ras多重遺伝子欠損マウスを作成した結果、N-rasホモ型欠損で且つK-rasヘテロ型欠損マウスは致死となること、K-ras欠損マウスにH-ras欠損が加わると胎生致死の時期が早期に移行すること等から、3つのRasタンパク質の間には重複する機能もあることが判明した。これは、K-ras遺伝子欠損マウスにヒトのH-ras遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが、正常に発生、成長することからも強く示唆された。さらに本研究は、2段階のジーンターゲッティングから成る標的遺伝子置換法を計画した。これは我々が開発した標的遺伝子置換法を用いて、K-ras遺伝子の第2エクソン内にH-ras cDNAを導入し、K-ras遺伝子発現制御下においてH-Rasタンパク質を発現するマウスを作成するものである。第1段階の、K-ras遺伝子の相同組換えは、順調に進行しマウスも作成された。しかし、第2段階のK-ras遺伝子をH-ras遺伝子に置き換える過程が難航し、未だ進行中である。一方、ヒトのH-ras遺伝子を導入することにより、胎生致死であるK-ras遺伝子欠損マウスやras多重遺伝子欠損マウスが救われて生存することから、CRE-loxPシステムを用いて遺伝子発現をコンディショナルに制御できるトランスジェニックマウスを作成した。このトランスジェニックマウスと胎生致死であるK-ras遺伝子欠損マウスとを交配した結果、生存するK-ras遺伝子欠損マウスが認められた。さらに、胎生致死であるras多重遺伝子欠損マウスが救われるかどうか交配を進めている。このトランスジェニックマウスは、任意の組織あるいは時期において導入遺伝子を欠失し、Rasタンパク質が全く存在しない状態を解析することができる。今後、胎生致死のため解析できなかった生体での生理機能と特異性を解明していきたい。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1998 - 2000

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】08458264 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マウス / 小脳 / プルキンエ細胞 / 登上線維シナプス / パッチクランプ / 生後発達 / 多重支配 / ノックアウトマウス

【研究成果の概要】

(1)正常動物登上線維応答の性質と生後発達: マウスの登上線維応答の性質を日齢をおって電気生理学的に調べた。生後1週から2週にかけて、登上線維による多重支配を受けるプルキンエ細胞の比率が大きく減少した。また、生後1週目の登上線維応答は、EPSCの立上り時間が遅いこと、登上線維2発刺激に対するpaired-pulse depressionの程度が強いことなど、成熟型の登上線維応答とは性質が異なっていた。また、ラットを用いてpaired-pulse depressionの性質を調べ、伝達物質放出減少がその主因であることを明らかにした。
(2)mGluR1、Gαq、PLCβ4ノックアウトマウスの解析: プルキンエ細胞では、代謝型グルタミン酸受容体1型(mGluR1)、3量体GタンパクGq、phospholipaseCβ4(PLCβ4)を介してprotein kinase Cγ(PKCγ)の活性化が起こると考えられる。mGluR1、Gqのαサブユニット(Gαq)、PLCβ4のノックアウトマウスを用いて登上線維シナプス発達に及ぼすこれらの関与を調べた。いずれも、生後3週目以降に約1/3のプルキンエ細胞が複数の登上線維による多重支配を受けており、この発達の異常は、以前報告したPKCγノックアウトマウスと同様であった。これらより、mGluR1-Gαq-PLCβ4-PKCγを介するシグナル伝達系が過剰な登上線維排除に必須であると考えられた。
(3)GluRδ2ノックアウトマウスの解析: プルキンエ細胞に特異的なδ2型グルタミン酸受容体(GluRδ2)ノックアウトマウスでは、小脳平行線維-プルキンエ細胞シナプスの形成が正常の約半分に低下していた。また、登上線維シナプスの電気生理学的性質を調べた結果、登上線維がプルキンエ細胞の遠位樹状突起に、過剰な異所性シナプスを形成していることがわかった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】8,700千円 (直接経費: 8,700千円)