【研究領域課題番号】22K06099 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2022-04-01 - 2025-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】20K20376 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂質二重膜 / X線結晶解析 / 膜蛋白質 / 結晶 / 結晶解析 / 結晶大型化 / 構造生物学

【研究成果の概要】

膜蛋白質の真の構造生物学を目指し、「脂質二重膜からプロトンまで」の全てを可視化する技術の開発に取り組んでいる。第一の目標は膜蛋白質結晶中の脂質二重膜の可視化であり、具体的課題は分解能10Åよりも低角の反射点の位相決定である。溶媒コントラスト変調法の拡張と多重同型置換法、その両者の組み合わせの適用を考え、技術開発とデータ収集を行った。さらに、中性子回折への発展を考え、膜蛋白質の大型結晶の作製技術の開発を試みた。

【研究の社会的意義】

本研究の結果、低角反射に対する位相決定技術が拡充され、既に実績のある溶媒コントラスト変調法に関しても適用できる結晶が大幅に拡大した。その結果、これまでX線結晶解析が機能しないためにごく限られた知見しかない、燐脂質と膜蛋白質との相互作用の詳細を明らかにすることが可能になった他、蛋白質結晶中で熱運動が大きくて解像できなかった糖鎖等も解像できるようになった。クライオ電子顕微鏡法では燐脂質頭部が解像されないことが多いため、本研究で開発した技術との組み合わせも追及されるべきであろう

【研究種目】挑戦的研究(開拓)

【研究期間】2020-04-01 - 2022-03-31

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究領域課題番号】19H00976 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自然免疫 / 構造生物学 / Toll様受容体 / クライオ電子顕微鏡 / 構造生物 / Nod様受容体 / TLR / X線結晶解析

【研究成果の概要】

自然免疫は病原体の感染をいち早く察知し炎症反応を引き起こす一方、後に続く獲得免疫を誘導するという極めて重要な役割を果たす。本研究では自然免疫に関わるタンパク質に注目し、リガンド認識機構、活性制御機構を明らかにすることを目的とした。細胞質型の自然免疫センサーとしてADP結合型のNOD2の構造解析に成功し、詳細な構造を明らかにした。またLRRドメインにリガンド結合部位と思われる領域を同定した。また一本鎖核酸を認識する膜結合型の自然免疫センサーであるTLRの構造研究にも取り組みその共通性を見出した。さらにmRNAの安定性を制御するRoquin-2の構造解析にも成功しそのRNA認識機構を明らかにした。

【研究の社会的意義】

NLRの構造は数例に限られており、NOD2の構造情報はNLRの活性化機構を解明するうえで重要な情報となる。すでに構造解析されているNLRの一つNLRC4と比べてもドメイン配置が大きく異なることが初めて明らかにされた。一本鎖核酸を認識するTLRが有する共通性「リガンド結合部位が2ヶ所あり別のリガンドが各部位に結合することにより協調的に活性化する」を解明したことは大きなインパクトを与えた。特にTLR7,8は低分子化合物によって活性化されることが知られており、立体構造情報はあらたな化合物開発に多大な貢献を示すと考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】45,890千円 (直接経費: 35,300千円、間接経費: 10,590千円)

【研究領域課題番号】18K06079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物化学 / X線結晶構造解析 / ABC輸送体 / 膜蛋白質 / 薬剤耐性 / 構造生物学 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析 / 膜輸送体

【研究成果の概要】

本研究では、ATPを利用して基質を能動輸送するATP-binding cassette（ABC）輸送体のうち、外膜チャネルと膜融合蛋白質と複合体を形成して基質の輸送を行う三者複合体形成型輸送体MacBについて、その基質輸送機構を解明することを目的とした。2017年に我々は分解能3.4オングストロームでMacBの結晶構造を明らかにしたが、本研究では新たに別のMacBホモログで分解能2.0オングストロームのより精密な構造解析に成功した。さらに複数の別条件の結晶からも構造を得た。それらの構造を比較することにより、MacBの構造変化が観察され、基質輸送機構の理解につながる新たな知見が得られた。

【研究の社会的意義】

本研究の対象であるMacBは、マクロライド系抗生物質やペプチド毒素、リポ多糖等の生物学的に重要な物質の排出に関与しており、その排出機構を解明することは、創薬のみならず生命現象の理解という観点からも非常に有用な情報が引き出せると期待される。本研究で明らかとなったMacBの構造変化は、従来のABC輸送体とは大きく異なるものであった。これらの結果から、詳細が解明されていないMacBを含むVII型ABC輸送体の基質輸送の分子機構について、新たなモデルを提唱した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】15K14471 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ダイオキシン / 環境ホルモン / 構造生物学 / Ｘ線結晶構造解析 / Ｘ線結晶解析

【研究成果の概要】

ダイオキシン受容体として知られる芳香族炭化水素受容体（AhR）の構造生物学的研究を進めた。核移行前複合体の調製を試みたが成功しなかった。AhR抑制複合体であるAhRR/ARNT複合体の結晶化を進め、その結晶構造を明らかにした。転写活性化複合体であるAhR/ARNT複合体の構造解析に向けて、種々の生物種由来のAhR/ARNT複合体の調製や、様々な変異体の発現と精製を試みた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23227003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ピクセル検出器 / タンパク質結晶構造解析 / タンパク質溶液散乱 / DEPFET検出器 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / X線溶液散乱 / X線結晶解析

【研究成果の概要】

タンパク質のＸ線構造解析用に、素粒子実験向けに開発された最新のピクセル型検出器DEPFET（DEpleted P-channel Field Effect Transistor）を応用した高精細高速読み出し検出器を制作した。放射光Ｘ線を用いた評価実験を行い、DEPFETが既存のＸ線検出器を上回る位置測定精度でタンパク質結晶や溶液からの回折像を撮影でき、しかも高速なヒット情報の取り出しが可能なことを示した。センサーモジュールを並べてメガピクセル級の大面積検出器を構成することで、高難度タンパク質の微小結晶構造解析や時分割溶液散乱へ適用され、新しい測定・解析技法が切り拓かれることが期待される。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2011-04-01 - 2016-03-31

【配分額】209,820千円 (直接経費: 161,400千円、間接経費: 48,420千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】17570097 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

相同組換え / 二重鎖切断修復 / 遺伝的組換え / Rad51 / Dmc1 / 減数分裂 / RecA / ATPase / タンパク質と酵素 / 核酸 / 遺伝子及び染色体 / 構造生物学 / X線結晶解析 / 生体高分子構造・機能 / 遺伝情報複製・再編 / 染色体構築・機能・分配

【研究成果の概要】

相同組換えは、DNAの二重鎖切断損傷の修復や減数分裂期での遺伝的組換えにおいて重要な役割を果たしている。相同組換えの要の反応である相同的対合は、バクテリアRecAおよび2種類の真核生物型RecAホモログであるRad51とDmc1によって触媒されることが知られている。これらの相同的対合タンパク質(RecA、Rad51、およびDmc1)は、WalkerタイプのATPaseモチーフを持ち、単量体としては酷似した立体構造を形成しており、自己会合によりらせんフィラメント状の四次構造を形成する。しかし、Dmc1は、このようならせんフィラメント状構造以外にも8量体のリング構造を形成することが明らかになった。Dmc1とRad51は、互いに50%以上のアミノ酸配列相同性を有するにも関わらず、Dmc1で見られる8量体のリング構造は、Rad51では観察されていない。このようなRad51とDmc1との問の四次構造における差異が、それらの相同組換えにおける役割の違いを生じていると考えられる。申請者らは、X線結晶構造解析法によって、すでにヒトDmc1の8量体リング構造を原子分解能で決定することに成功している。そこで本年度は、このDmc1のリング構造形成の分子機構1を明らかにするために、ヒト由来のRad51とDmc1とのキメラタンパク質のデザインを行った。それらのRad51/Dmc1キメラタンパク質を用いて物理化学的および生化学的解析を行い、Rad51およびDmc1のリング-フィラメント構造の変換機構の解析を行う予定である。また、Rad51およびDmc1の性質に変化を生じる変異体の作製に成功した。これらの点変異体Rad51およびDmc1の物理化学的および生化学的解析の結果、Rad51のDNA結合部位やDmc1のリング構造形成に重要なアミノ酸残基の特定に成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】15770076 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝情報再編 / 生体高分子構造・機能 / 遺伝子及び染色体 / タンパク質と酵素 / 核酸 / 構造生物学 / X線結晶解析 / 染色体構築・機能・分配

【研究成果の概要】

ゲノムDNAは細胞内において常に損傷を受けている。中でも二重鎖切断損傷は、染色体異常の直接的な原因となる。二重鎖切断は、相同組換えを経由したDNA修復経路によって速やかに修復されるが、そのメカニズムについては生化学的にも構造生物学的にも解析が進んでおらず、その分子機構の理解は不十分である。相同組換え反応の要の反応は相同的対合反応である。相同的対合反応の分子機構を明らかにするために、減数分裂期での相同対合反応の中心酵素であるヒトDmc1の立体構造解析をX線結晶回折法によって行い、Dmc1が8量体のリング構造を基本とする16量体のダブルリング構造を形成することを明らかにした。そして立体構造に立脚した変異体解析によって、Dmc1の16量体ダブルリングにおけるDNA結合部位を同定した。Dmc1ダブルリングの中央の穴は約30オングストロームの直径をもち、その中央の穴に糸を通すように二重鎖DNAを結合することが分かった。単鎖DNAは、ダブルリング構造の側面に存在する単鎖DNA専用の溝に結合することを変異体解析によって明らかにした。また、出芽酵母の遺伝学的解析より、Dmc1と機能的な相互作用が示唆されているTBPIP/Hop2に着目し、リコンビナントタンパク質として大量に精製する系を確立した。そして精製されたTBPIP/Hop2が、Dmc1によって触媒される相同的対合反応を著しく活性化することを見いだした。TBPIP/Hop2のドメイン解析を、欠失変異体作製法によって行った結果、TBPIP/Hop2はN末端領域にてDNAに結合するが、C末端領域はDmc1依存的な相同的対合反応の活性化に重要であることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)