【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】11878112 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 膜蛋白 / 結晶化 / 膜輸送 / 薬剤排出 / テトラサイクリン

【研究成果の概要】

1、テトラサイクリン排出タンパクの結晶化及び結晶構造解析に向けて、その基盤となる大量産生と大量精製法の条件検討を行った。その結果、1週間ほどの培養〜精製の行程で、30mg程の純化したテトラサイクリン排出タンパクを得る系の確立に成功した。この量は結晶化の実験に用いるには不足は無く、結晶化実験に向け基盤を固めることができた。
2、膜蛋白質の結晶化に於いて最も影響の大きな因子の一つである界面活性剤の選択に関して本年度は、その可溶化力を市販の物ほぼ全てに関してその効果を検討した。約100種類の界面活性剤のうち、ある種の合成リン脂質誘導体が蛋白質を効率よく膜から可溶化し、且つ精製後も蛋白質標品を安定に保つ事を見出した。この界面活性剤で安定化させたテトラサイクリン排出タンパクは水溶液中でも安定で結晶化が起こる一般的な蛋白濃度である10mg/mLもの高濃度でも非特異的会合を起こさない事が分かった。今後、界面活性剤の蛋白質標品の安定化に及ぼす影響をさらに検討する。
3、生物分子工学研究所(BERI)木村能章博士との共同研究により、精製したテトラサイクリン排出タンパク分子を合成リン脂質シートに再構成し、相転移によりシート中のたんぱく質濃度を上昇させる手法で初歩的な2次元結晶化に成功した。このシートの電顕像のフーリエ変換像には分子配列に規則性があることを示すピークが認められた。
4、3次元結晶化に関しては、市販の結晶化条件スクリーニングキットを用いて初歩的なスクリーニングを行った。今後リン脂質の系に再構成する条件検討の結果を応用し、Lipid cubic phase 法による結晶化を行って行く予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】03304056 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜タンパク質 / 結晶化 / X線結晶構造解析 / 結晶成長機構 / タンパク質立体構造予測 / 超分子複合体 / タンパク質立体構造形成機構 / 電子線構造解析 / 結晶構造解析 / チトクロム酸化酵素 / チトクロムbc_1複合体

【研究成果の概要】

過去3か年にわたる研究の結果、膜タンパク質スーパーコンプレックスの構築原理と結晶化条件の一般化に関して以下のことが明かになった。
膜タンパク質の立体構造の安定化の要因は膜貫通ヘリックス間の水素結合と静電的相互作用である。それに加えて、親水性部分が安定化に寄与している。したがって、脂質二重膜に埋まった疎外性表面を界面活性剤で覆って水溶液中に‘可溶化'することは立体構造を損なわずに膜タンパク質を単離する最もよい方法であろう。しかし、この結合している界面活性剤を介した相互作用は非特異的で、結晶の安定化に寄与するとは考えられない。したがって、親水性部分の大きな膜タンパク質ほど結晶化は容易であると推定できる。ウシ心筋チトクロム酸化酵素やチトクロムbc_1複合体は結晶化されているが分子量がそれらの約1/2である細菌の相同タンパク質はまだ結晶化されていないことは、この推定を支持している。結晶化の必要条件は標品の純度ではなく立体構造が完全であることである。さらに周期的な配列が可能になるためには、必ずしも分子間の相互作用が強ければよいわけではない。界面活性剤の種類によってこのような相互作用を制御することができる。例えば、チトクロム酸化酵素結晶のx線回析の分解能を6.5Aから3.5A以上に、界面活性剤の種類を変えることによって、一挙に向上させることができた。巨大な分子の結晶では、安定化を促進する相互作用が体積当りでは弱くなるため、結晶の完全性に限界があるという説もあるが、逆にいくら大きくてもそれが生理活性をもったタンパク質であるかぎり結晶化は可能であるとも考えられる。何故なら大きなタンパク質ほど立体構造の動的なゆらぎを小さくするような構造があるため、全体として安定であるだけでなく、特異的な相互作用も揺らぎが小さいだけ強くなるであろうからである。

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1990 - 1993

【配分額】17,000千円 (直接経費: 17,000千円)