【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09480199 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / 骨形成因子 / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / 遺伝子ターゲッテイング / レセプター / アクチビン / アポトーシス

【研究成果の概要】

1. Tkv結合蛋白質クローニングとその哺乳類細胞での機能解析:ショウジョウバエのセリン-スレオニンキナーゼ型レセプターであるThick veins(Tkv)に結合する蛋白質をtwo-hybrid法で検索し、DIAP1(Drosophila apoptosis inhibitor-1)をクローニングした。
2. Smadのシグナル伝達機構における役割:我々はSmadファミリーの分子をその構造と働きから、特異型、共有型、抑制型の3種類に分類できることを明らかにした。また新しいSmad分子であるSmad6をクローニングした。Smad6は他のSmadの作用を抑制する抑制型Smadであることが明らかとなった。
3. 骨形成因子のシグナル伝達におけるSmadの役割と遺伝子導入による解析:アデノウイルスベクターに組み込んだSmad1やSmad5を骨芽細胞前駆細胞に導入してその作用を調べた。Smad1やSmad5は単独で細胞に感染させても骨芽細胞への分化誘導活性は低いが、低濃度のBMPや活性化型レセプターを加えると、作用の劇的な増強が見られた。
4. TGF-βシグナルに関与するSmad3の変異体の機能解析と腫瘍形成能:Smad3の407番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異を作り、その作用を検討した。変異型Smad3はTGF-βのシグナルを伝達しないだけでなく、優勢抑制型変異体として作用した。変異型Smad3を大量に発現している細胞ではTGF-βの増殖抑制作用に対し抵抗性になっていた。さらにこれらの細胞をコラーゲンゲルの上で3次元培養するとコラーゲンゲルの中に細胞が浸潤していく像が見られた。
5. シグナル伝達分子の遺伝子ターゲッテイング:BMPレセプターII型遺伝子およびSmad2のターゲッテイングを行った。いずれも発生初期の段階で致死的であった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】15,100千円 (直接経費: 15,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】08458233 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / アクチビン / 骨形成因子 / レセプター / シグナル伝達 / セリン・スレオニンキナーゼ / 血管新生 / 皮膚角化細胞 / セリン-スレオニン・キナーゼ

【研究成果の概要】

1.GDF-5のレセブターの同定:我々はBMPファミリーに属する新しい因子GDF-5(growth/differentiation factor-5)のレセブターとの結合と機能解析を行った。GDF-5は2種類のBMPのI型レセプター(BMPR-IAとBMPR-IB)のうちBMPR-IBにのみ特異的に高い親和性で結合することが明らかになり、他のBMPファミリーとの特性の違いが明らかとなった。
2.GDF-5の血管新生作用:我々はBMP-2やGDF-5の血管新生作用を検討し、TGF-βやアクチピンと比較した。その結果、in vivoのアッセイ(CAMアッセイやウサギの角膜アッセイ)でGDF-5に血管新生作用があることが確認されたが、BMP-2には血管新生作用はなかった。血管新生のメカニズムを明らかにするためにウシ大動脈由来の培養血管内皮細胞に対するGDF-5の作用を調べた結果、内皮細胞の遊走やプラスミノーゲンアクチベータの産生を促進することが明らかになり、血管新生のメカニズムが明らかとなった。
3.皮膚におけるアクチピンの分化誘導作用:皮膚におけるアクチピンの細胞増殖・分化への作用を調べる目的で、ヒト皮膚組織の免疫組織化学的検討と培養角化細胞におけるその機能の検討を行った。正常ヒト皮膚組織や培養角化細胞HaCaTにおいてIB型レセブター(ActR-IB)、II型レセブターの発現が見られた。アクチピンAは培養角化細胞に作用し分化誘導作用を示したが増殖抑制作用は軽度であった。これに対しTGF-βは増殖を強く抑制するが、分化は誘導しなかった。シグナル伝達分子Smad2やSmad3のリン酸化にアクチピンとTGF-βで明らかな違いが見られ、アクチピンではSmad3により特異的な活性化が見られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996

【配分額】6,300千円 (直接経費: 6,300千円)

【研究分野】病体医化学

【研究領域課題番号】07557334 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / アポトーシス / セリン-スレオニン・キナーゼ / アクチビン / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)は細胞の増殖を抑制するほか多彩な作用をもった生理活性物質である。TGF-βは二種類のセリン-スレオニンキナーゼ型レセプター(I型、II型)によってシグナルを伝達し、細胞内ではSmadという蛋白質を介してシグナルを伝達する。本研究では以下のプロジェクトについて研究を行った。
1)TGF-βI、II型レセプターの種々の疾患における発現:網膜芽細胞腫や扁平上皮癌、前立腺癌などを中心にレセプターの発現と変異の有無を検討した。網膜芽細胞腫の培養細胞株ではII型レセプターの発現を認めないが、分化にともない発現が見られた。II型レセプターのプロモーター領域には変異は見られなかった。またI型レセプターにも異常があることが示唆されたが、Smadには異常は見られなかった。前立腺癌でもI、II型レセプターの発現の低下を認めた。
2)TGF-βレセプターの細胞内基質の同定とcDNAクローニング:酵母を用いたtwohybrid法により、ショウジョウバエのI型レセプターThick veinsの基質となるペプチドしてDIAP1(Drosophila inhibitor of apoptosis-1)をクローニングした。
3)シグナル伝達分子Smadの作用と疾患における異常の検討:TGF-βレセプターのシグナル伝達分子Smad2の異常を同定するため、遺伝子構造の決定を行った。さらにSmad2にはエクソン3が転写されないタイプのものが存在することを明かにした。エクソン3のないSmad2はこれをもつものよりも活性が高い可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】07457032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / リン酸化 / シグナル伝達 / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / 増殖抑制 / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

1. β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)のII型レセプターによるI型レセプターの活性化
TGF-βはまずII型レセプターに結合し、この結果I型レセプターをリン酸化して活性化するが、そのさいI型レセプターのGSドメインとよばれる構造が重要であることがこれまでに知られている。今回我々は、I型レセプターの膜貫通領域とGSドメインの間に位置する領域(以下、JM領域)のシグナル伝達における重要性を明らかにした。さらにII型レセプターとI型レセプターのリン酸化部位の同定を試み、II型レセプターでは膜貫通領域とキナーゼ活性領域の間に位置する領域とC末端領域が、またI型レセプターではJM領域とGS領域のセリンやスレオニンがリン酸化されることを確認した。今後はリン酸化によってどのようなシグナルが伝えられるかを明らかにする。
2. TGF-βI型レセプターの細胞内基質の同定とシグナル伝達機構
我々は酵母を用いたtwo-hybrid法によってTGF-βI型レセプターの基質となるペプチドのクローニングを試みた。その結果FKBP12(免疫抑制剤であるFK506やラパマイシンの細胞内結合ペプチド)やfarnesyl transferase-αを見出した。さらに最近ショウジョウバエ由来のI型レセプターであるthick veinsやsaxophoneに結合するタンパク質の同定をtwo-hybrid法で試みた。その結果、FKBP-12の他、少なくとも3つの新しいタンパク質が結合することが明らかとなった。今後はこれらのタンパク質のシグナル伝達における役割、とくに増殖抑制やアポトーシスへの効果を検索する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1995

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)