Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

イオンチャネル / 出芽酵母 / 液胞 / カルシウム / 酵母 / Ca2+ / トランスポーター / チャネル

出芽酵母TRPチャネルTRPY1の活性調節機構の解明を行なった。 TRPY1は高浸透圧ストレスによって活性化して液胞から細胞質にCa2+を放出し、PI(3,5)P2合成酵素欠損株ではこの高浸透圧応答が消失する。この知見から、TRPY1の高浸透圧応答にPI(3,5)P2が必要もしくはPI(3)Pの蓄積によってTRPY1が抑制される可能性が推察される。本課題を明らかにするためにPI(3)P処理した酵母液胞膜を用いて電気生理学的測定であるパッチクランプ法を用いた活性測定を行なったところ、TRPY1活性の低下を見出した。このことより、PI(3)PによってTRPY1が抑制されることを明らかにした。

昆虫 / 社会性昆虫 / ミツバチ / 高次行動 / 記憶学習 / キノコ体 / cDNA / カルシウム / 記憶 / Ca^<2+> / IP3受容体 / cDNAクローニング / RNA / 膜翅目

ミツバチは社会性昆虫であり、ダンス言語などの他の昆虫には見られない多彩な社会行動を示す。しかしながら、ミツバチのように小さな脳を持つ昆虫が、どうしてこのような高次行動を示すことができるのかは全く不明である。ミツバチの脳では、感覚統合や記憶の中枢と考であるキノコ体が他の昆虫に比べて顕著に発達しており、キノコ体の機能の高度化が、その高度な社会行動の基盤となった可能性がある。本研究ではミツバチの高次行動を規定する遺伝子の候補として、キノコ体特異的に発現する遺伝子をDifferential display法にて検索し、以下の成果を得た。
1、ミツバチのキノコ体を構成する2種の介在神経細胞(ケニヨン細胞)の内、大型ケニヨン細胞特異的に発現するM5遺伝子と、小型ケニヨン細胞特異的に発現するKs遺伝子を世界で初めて同定した。これらの遺伝子の転写産物はいずれも有意なORFを含まないことから、非翻訳性RNAとして機能する可能性が考えられた。また、これらの遺伝子の蛹の脳での発現解析から、ミツバチのキノコ体が、それぞれ固有な遺伝子を発現する2つの領野を含む、4つの繰返し構造からなることが示された。今後、これらの遺伝子産物の機能解析を通じて、ミツバチの高次行動を支えるキノコ体の内部構造と、その機能分担の分子メカニズムが解明されるものと期待される。
2、さらに、ミツバチのケニヨン細胞では細胞内カルシウム情報伝達系に働く遺伝子群(IP3受容体、CaMKII、PKCの遺伝子)の発現増強が起きていることを示した。ショウジョウバエでは、これらの遺伝子はともに脳皮質に一様に発現すると報告されている。神経細胞におけるカルシウム情報伝達系は、多くの動物種で記憶や学習の成立に重要と考えられているが、ミツバチでは、カルシウム情報伝達系の機能が亢進することにより、キノコ体のシナプスの可塑性が増強している可能性が指摘できる。昆虫の脳機能と行動の系統進化といった観点から、非常に興味深い知見であると思われる。

気孔 / 青色光効果 / プロトンポンプ / 情報伝達 / リン酸化 / 脱リン酸化 / 蛋白質リン酸化酵素 / 蛋白質脱リン酸化酵素 / 光情報伝達系 / プロテインキナーゼ / プロテインフォスファターゼ / Guard cell / Stomata / Ilne light response / Ca^<2+> / H^+-ATPane / Proton pumping / adaxial epidermis / proten phompnosylatin / 孔辺細胞 / ミオシン軽鎖キナーゼ / カルシウム / 蛋白質のリン酸化

孔辺細胞プロトプラストを用いて青色光依存のプロトン放出に関与するプロテインキナーゼのクローニングを試みた。青色光依存のプロトン放出はミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)阻害剤で阻害されることから、この反応にMLCK様タンパク質が関与することが示唆されていた。孔辺細胞中にニワトリ砂嚢のMLCK抗体と反応するタンパク質の存在を見出したので、この抗体を用いて新たに作製した孔辺細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングすると、2個のポジティブクローンが得られた。このクローンはそれぞれ3および4キロベースのcDNAを持っていた。それぞれVFPK1,VFPK2と名付けられたcDNAの塩基配列を決定すると、互いに88%の相同領域を有していたので、まず、VFPK1について詳しく調べた。VFPK1は4個のオープンリーディングフレイムを持ち(ORF1-4)、ORF2はプロテインキナーゼに相同な領域と、キナーゼに必須なサブドメインを有しており、MLCKと約17%の相同性があった。このタンパク質を大腸菌体内に過剰発現させ、そのキナーゼ活性をミエリン塩基性タンパクを基質とするゲル内リン酸化法により測定すると、高い活性が認められた。そこで、このタンパク質を抗原として抗体を作製した。この抗体は孔辺細胞中の17および32kDのタンパク質と反応した。このうち17kDのものは孔辺細胞葉緑体中に、また、32kDのものは細胞質中に存在していた。さらに、詳しく相同性検索を行うと、このORF2はArabidopsisにおいてレトロトランスポゾンの一種として報告されている遺伝子と相同性が高かった。また、ORF4はショジョウバエで報告されているレトロトランスポゾンの逆転写酵素と41%の相同性があった。以上の結果に基づくと、得られたcDNAのコードするタンパク質はプロテインキナーゼ活性を有し、孔辺細胞中に発現し、かつMLCKとある程度の相同性を有していた。しかし、それが青色光依存のプロトン放出に関与するかどうかについては、さらに検討が必要である。

【研究分担者】
木下俊則	九州大学	理学部	教務員	(Kakenデータベース)
土井道生	九州大学	理学部	助手	(Kakenデータベース)
和田元	九州大学	理学部	助教授	(Kakenデータベース)