【研究領域課題番号】21K19065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

テルペン / 生合成 / 遺伝子 / 酵素 / 環化 / 反応機構

【研究成果の概要】

当該代表者は、既知のテルペン合成酵素とはアミノ酸配列相同性を示さず、また既知の金属結合モチーフをもたない、生物活性物質Xの生産に関与する新しいテルペン合成酵素Yを発見した。そこで、本研究では、新たに発掘する酵素の機能解析を行うことで、これまで誰も入手し得なかったテルペン化合物の発見を目的とした。
初年度は、テルペン合成酵素Y（TC2）をコードする遺伝子を大腸菌で発現させて組換えタンパク質を得て、機能解析を行うことを目的とした。TC2遺伝子をクローニングしたプラスミドpET-28a(+)-TC2で大腸菌BL21(DE3)を形質転換して、TC2が可溶性画分として得られる培養条件を検討した。その結果、TB培地を用いた際、誘導剤であるIPTGが10 microMでわずかに発現、100 microMではTC2は大量に発現したが、ほとんど可溶画分には検出されなかった。さらに、Hisタグを用いて組換えTC2を精製するため、Ni-NTAレジンカラムで精製を試みたところ、可溶性酵素として0.3 mg程度得られた。次に、この精製した酵素に基質と考えられたGGDPとMg2+を加えてインキュベートし、反応産物を酢酸エチルで抽出、濃縮後、GC-MSで分析したところ、TC2を発現させた組換え麹菌で生産された生物活性物質Xと同一物質であることが判明した。以上の結果より、TC2が生物活性物質Xを生合成する酵素遺伝子であることを明らかにすることができた。これは、生物活性物質Xの生合成遺伝子を同定した初めての例として重要な知見である。
加えて、酵母であるPichia pastorisを用いたTC2の組換え酵素の取得も検討した。しかしながら、市販のPichia Expression Systemを購入してTC2の発現を試みたが、この系ではTC2の発現はまったく検出されなかった。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2021-07-09 - 2023-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究領域課題番号】21H02127 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 生合成 / 放線菌 / ヌクレオチド / 遺伝子 / 酵素 / 核酸系化合物 / 反応機構

【研究成果の概要】

本研究課題では、核酸系天然化合物の生合成酵素の精密機能解析を行い、得られた機能情報をもとに各種生合成酵素の理論的機能改変を行うことで新規な核酸系化合物を創出することを目的としている。2021年度ではまず、放線菌Streptomyces angustmyceticus NBRC 3934株の生産するangustmycin類の生合成機構の詳細を明らかにし、次いでこの生合成機構を改変することで、angustmycin誘導体の生産系の構築を行うことを目指した。それまでに、新規脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの鍵変換反応を担い、特異な構造であるexo-glycalを形成することを見出した。そこで、Agm6をコードする遺伝子の周辺を探索することにより、angutmycin Cの生合成に関与する遺伝子の機能解析を行った。その結果、agm1からagm6の6個の遺伝子によって生合成されることを、これら6個の遺伝子を異種放線菌であるStreptomyces albusに導入したところangutmycin Cとangustmycin Aの生産が確認されたことから結論づけることができた。また、Streptomyces decoyicusのゲノム配列にも、agm1からagm6の相同遺伝子が存在することも明らかにした。さらには、脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの変換反応を触媒する際に必要な補酵素はNAD+であり、NADP+は機能しないことも明らかにした。
本研究成果は、核酸系抗生物質angustmycinの生合成遺伝子を初めて同定し、その生合成経路を推定したものである。また、天然化合物としては稀なexo-glycal構造の形成機構を明らかにしたものとして重要である。これらの成果をまとめて、The Journal of Antibiotics誌で発表した。別の核酸系天然化合物であるA-94964の立体化学については、国際共著として発表することができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】天然資源系薬学

【研究領域課題番号】16F16410 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生合成 / 酵素 / 遺伝子 / 反応機構 / 物質生産

【研究成果の概要】

本研究では、メロテルペノイドの生合成マシナリーの精密機能解析と物質生産を主たる目的とした。漢方薬霊芝として利用される、担子菌Ganodermaに特徴的な、極めて新奇で複雑な骨格を有する生理活性メロテルペノイドの生合成研究に着手した。まず、生産菌のドラフトゲノム配列の解読により、候補となる生合成遺伝子クラスターを探索し、数種のP450酵素を含む生合成経路を確立と物質生産系の構築をめざした。現在継続進行中。
同時に、各種重要な生物活性を示す一連のインドールアルカロイドの生合成研究にも着手し、ハパインドール骨格構築の鍵となるプレニル転移酵素AmbP1, AmbP3のＸ線結晶構造解析にも取り組んだ。大腸菌に発現、精製した組み換え酵素の結晶構造解析により、２オングストロームの分解能で酵素立体構造の取得に成功した。関連酵素との構造の比較、立体構造に基づく部位特異的変異の導入などにより、活性部位を構成するアミノ酸残基を同定し、酵素反応機構、および、構造機能相関の解明に成功した。研究成果を印刷公表した。

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2016-10-07 - 2019-03-31

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】15H01836 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

合成生物学 / 生合成 / 酵素 / 遺伝子 / 物質生産 / 構造生物学 / 反応機構

【研究成果の概要】

複雑骨格天然有機化合物の生合成反応機構の解明と物質生産を目的とした。テレオシジンB、カリクリンＡ、アンチマイシン、メロテルペノイド、テルペノイド、インドールアルカロイド、ポリケタイドなど、各種複雑骨格天然物の生合成マシナリーの詳細や酵素反応機構の立体構造基盤の解明に成功し、一連の研究成果を印刷公表した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】40,300千円 (直接経費: 31,000千円、間接経費: 9,300千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】26560428 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ポリケタイド合成酵素 / 生合成 / 遺伝子 / 生合成工学 / 合成生物学 / ポリエン化合物

【研究成果の概要】

ポリエン化合物の生合成遺伝子の進化の様式と、酵素の活性機能相関を明らかにすることを目的とした。ポリエンtetrafibricin産生菌より、その新規中間体neotetrafibricinの構造を同定し、生合成遺伝子クラスターを取得した。ポリエン合成酵素の遺伝子比較から、ケトシンテースドメイン中の、スターター基質特異性に関わるアミノ酸配列を見出した。ポリケタイドの伸長基質供給酵素AntEの立体構造解析、基質特異性の拡大に成功し、新規antimycin化合物の生産に成功した。本研究により、新規化合物生産のための遺伝子改変の基盤が構築された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】24651239 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

オカダ酸 / 生合成 / 遺伝子

【研究成果の概要】

オカダ酸生産渦鞭毛藻Prorocentrum hoffmanianumより、オカダ酸の生合成に関わるポリケタイド合成酵素遺伝子の同定を目的とした。微生物由来PKSの保存アミノ酸を元に設計したプライマーを用い、藻体由来DNAより二種の、葉緑体由来DNAより一種の新規PKS遺伝子配列を取得した。また、高分解能LC-MSを用いて、藻体のタンパク質分析を行い、PKS酵素断片と思われるペプチド配列の取得に成功した。今後、得られたペプチド部分配列を用いて、DNAライブラリーをスクリーニングすることで、オカダ酸生合成遺伝子クラスターを同定する。渦鞭毛藻由来複雑骨格天然物の生合成機構の全容解明が期待される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】20310136 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生合成 / 二次代謝酵素 / 結晶構造解析 / 酵素工学 / 物質生産 / 生合成工学 / ポリケタイド / 酵素 / 遺伝子

【研究成果の概要】

多様な構造と生物活性を有する一連の植物ポリフェノールの基本骨格を生合成するIII型ポリケタイド合成酵素について、X線結晶構造解析により得られた立体構造情報に基づき、部位特異的変異を導入することにより、これまで困難とされてきた合理的な酵素触媒機能の改変に成功した。また、これら酵素が示す寛容な基質特異性を利用して、人工基質を作用させることにより、在来見られない骨格を有する非天然型新規化合物の生産に成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】20241049 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生合成 / メロテルペノイド / 遺伝子 / 糸状菌 / 遺伝子クラスター / ピリピロペン / テレトニン / ポリケタイド合成酵素 / テルペン環化酵素 / 基質特異性 / プレニル基転移酵素 / Aspergillus fumigatus / ニコチン酸

【研究成果の概要】

糸状菌ゲノムデータベースを対象に、ポリケタイド合成酵素およびプレニル基転移酵素の共存する遺伝子クラスターを検索することで、2種のメロテルペノイド生合成遺伝子クラスターを見いだし、各酵素遺伝子を異種糸状菌で発現することにより機能同定した。これらの酵素はいずれも既知生合成酵素とは反応性、特異性を異にする新規な酵素であり、天然物の構造多様性拡大への貢献が期待される。また、異種糸状菌での共発現によるメロテルペノイド生合成系の再構築に成功し、さらに、非生理的基質を出発基質とすることで非天然型新規メロテルペノイドの生成に成功した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】30,290千円 (直接経費: 23,300千円、間接経費: 6,990千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】17780063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

staurosporine / rebeccamycin / Streptomyces / 二次代謝産物 / 生合成 / 遺伝子 / 放線菌 / インドロカルバゾール

【研究成果の概要】

インドロカルバゾール骨格を有する天然化合物は、放線菌由来の産物を主として多数報告されている。強力なプロテインキナーゼ活性を有するスタウロスポリン(STA)やDNAトポイソメラーゼ阻害剤であるレベッカマイシン(REB)など多くの興味深い生理活性物質が存在するために、医薬品などへの産業利用が期待される化合物群である。その生合成経路については、これまでほとんど知られていなかったが、近年、我々のグループの他、複数の欧米グループの精力的な研究により生合成機構の全貌が遺伝子レベルで明らかになった。これらの成果によってコンビナトリアル生合成を用いた新規アナログ創製法なども実現しつつあり、インドロカルバゾール医薬品の創製等が期待されるまでになっている。
本研究では、インドロカルバゾール骨格の生合成に関与するユニークな酵素群の反応機構の解明について行った。
(1)クロモピロリン酸合成酵素
STA生合成経路において、IPAよりCPAを生成する酵素・StaDは既知蛋白とのアミノ酸配列上の相同性が見られないユニークな酵素である。我々は大腸菌を用いて活性型のStaD酵素発現を行い、4量体構造を取る巨大ヘモプロテインであることを明らかにした。
(2)本生合成に関与する2つのP450酵素
StaDによって生成するCPAはその後2段階の酸化反応を経てSTAアグリコンへと変換される。本酸化反応の詳細は未知であるが、StaC, StaPの2つの酵素が関与することが明らかになっている。このうち、StaPはP450酵素である。一方、STAアグリコンと糖部位は2ヶ所のC-N結合によって結ばれているが、このうちの1ヶ所はP450ホモログであるStaNが関与している。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】生物生産化学・生物有機化学

【研究領域課題番号】16780080 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

放射菌 / ポリケタイド / 生合成 / 糖 / マクロサイクリック化合物 / 脱水酵素 / 放線菌 / 遺伝子

【研究成果の概要】

本研究では、放線菌Streptomyces versipellis 4083-SVS6株が生産するバーシペロスタチン(VST)の生合成遺伝子のクローニングとその精密機能解析を通して、VSTの生合成機構を解明することを目的としている。VSTはI型ポリケタイド合成酵素で合成される既知の化合物とは構造が異なり、α-アシルテトロン酸構造を含む17員環マクロサイクリック化合物である。よって、α-アシルテトロン酸構造を形成するための生合成遺伝子群の取得、およびその生合成機構の解明により、I型ポリケタイド合成酵素で合成される化合物の新たなスターターユニットとその生合成遺伝子が解明され、新たな改変可能なα-アシルテトロン酸構造が加えられることになると考えられる。VSTの生合成遺伝子をクローニングするため、エリスロマイシンやエバーメクチンの生合成遺伝子中で特に保存されているケト体合成酵素(KS)とアシル基転移酵素(AT)の領域を含むPCR用プライマーを用い、VSTの生合成に関与するKSとATの領域を4083-SVS6株からクローニングした。塩基配列を決定した結果、少なくとも5種類のKS-AT領域の配列が含まれていることが判明した。ついで、VSTはdigitoxoseとcymaroseを含んでいるため、これらの糖の生合成に共通の酵素と考えられるdTDP-glucose-4,6-dehydrataseをクローニングするためのPCR用プライマーを設計し、4083-SVS6株からクローニングを試みた。その結果、予想通り495bpの大きさのDNA断片が増幅され、その塩基配列を決定したところ、その他の放線菌からクローニングされているdTDP-glucose-4,6-dehydrataseと70%から80%の相同性を示すことが明らかとなった。今後は、これらKS-AT領域とdTDP-glucose-4,6-dehydrataseを含む2つのDNA断片をプローブとして用いて、4083-SVS6株のコスミドライブラリーの中から陽性クローンを選択することにより、VSTの生合成遺伝子クラスターを取得する。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】14760052 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

staurosporine / rebeccamycin / Streptomyces / 二次代謝産物 / 生合成 / 遺伝子 / 放線菌

【研究成果の概要】

インドロカルバゾール誘導体の創製とその生理活性
レベッカマイシン、スタウロスポリンはLechevalieria aerocolonigenes ATCC39243及びStreptomyces sp. TP-A0274株が生産するインドロカルバゾール化合物である。これら生産菌より生合成遺伝子をクローニングし、組換えることにより非天然型インドロカルバゾール化合物の生産を行った。現在までに15種類の化合物の生産に成功した。このうち、CCAはHuman DNA topoisomeraseI及びIIに対して阻害効果が見られた。また、staN破壊株が生産するHolyrine AはHuman U937 cellに対して0.2mMの濃度でアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。
新規トリプトファン水酸化酵素遺伝子tox1の機能解析
複素環化合物を直接水酸化することは、従来の有機合成的手法では困難である。他方、Streptoverticillium sp. BA13793株は、インドール環の7位に水酸基を持つインドロカルバゾーノレ(IC)化合物BE-13793Cを生産する。そこでBE-13793Cの生合成遺伝子クラスターから新規トリプトファン水酸化酵素遺伝子をクローニングし、その遺伝子を発現させ、機能解析を行った。
tox1は1,566塩基からなる新規水酸化酵素遺伝子であり、スタウロスポリンのアグリコンを生産するStreptomyces lividans pTYMC sta7株に導入したところ、スタウロスポリンのアグリコンの10位が水酸化された化合物を産生した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】3,800千円 (直接経費: 3,800千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】12760063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

スタウロスポリン / レベッカマイシン / インドロカルバゾール / 生合成 / Streptomyces / Lechevalieria / 遺伝子 / レべッカマイシン / 生合成遺伝子 / Saccharothrix / Violacein

【研究成果の概要】

スタウロスポリンの遺伝子を直接クローニングすることは困難であることが予想されたために、今年度も前年度に引き続きレベッカマイシンの生合成に関する研究を行った。レペッカマイシン(Rm)はスタウロスポリンと同様にインドロカルバゾール(IC)骨格を持つ化合物でDNA topoisomeraseIの特異的阻害剤である。IC化合物の生合成についてはトリプトファン(trp)2個が前駆体であることが明らかになっているが、その生合成過程は未知である。前年度においてRm生合成遺伝子のクローニングについて報告したが、今年度はその全生合成経路について推定できた。Rm生合成遺伝子が存在すると思われるコスミドクローン、pREBCN5をRm生産菌、Lechevalieria aerocolonigenesATCC39243よりクローニングした。この内のPstI-BamHI15.5kbの塩基配列を決定した結果、10個のorf, reb clusterの存在を確認した。rebB, C, D, E, H, ngtの遺伝子破壊株を作製し、その中間代謝物の同定を行い、その結果を基にRm生合成経路を推定した。今回の結果より導かれた生合成経路は、trp2分子がクロル化後、酸化により生じた1分子のα-ケト酸がもう1分子と脱水縮合して環化した3,4-di-(3-(8-chloroindolyl)-pyrrole 2,5-dicarboXylic acidが形成され、更にRebC, RebDによる変換反応の末にRmアグリコンが形成されるという経路である。また、得られた遺伝子情報を基に念願のスタウロスポリン生合成遺伝子のクローニングにも成功した。今回の結果よりスタウロスポリン生合成においてもアグリコン形成はレベッカマイシンとほぼ同じ経路で生合成されると予想される。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)