Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

核酸 / 生合成 / 放線菌 / ヌクレオチド / 遺伝子 / 酵素 / 核酸系化合物 / 反応機構

本研究課題では、核酸系天然化合物の生合成酵素の精密機能解析を行い、得られた機能情報をもとに各種生合成酵素の理論的機能改変を行うことで新規な核酸系化合物を創出することを目的としている。2021年度ではまず、放線菌Streptomyces angustmyceticus NBRC 3934株の生産するangustmycin類の生合成機構の詳細を明らかにし、次いでこの生合成機構を改変することで、angustmycin誘導体の生産系の構築を行うことを目指した。それまでに、新規脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの鍵変換反応を担い、特異な構造であるexo-glycalを形成することを見出した。そこで、Agm6をコードする遺伝子の周辺を探索することにより、angutmycin Cの生合成に関与する遺伝子の機能解析を行った。その結果、agm1からagm6の6個の遺伝子によって生合成されることを、これら6個の遺伝子を異種放線菌であるStreptomyces albusに導入したところangutmycin Cとangustmycin Aの生産が確認されたことから結論づけることができた。また、Streptomyces decoyicusのゲノム配列にも、agm1からagm6の相同遺伝子が存在することも明らかにした。さらには、脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの変換反応を触媒する際に必要な補酵素はNAD+であり、NADP+は機能しないことも明らかにした。
本研究成果は、核酸系抗生物質angustmycinの生合成遺伝子を初めて同定し、その生合成経路を推定したものである。また、天然化合物としては稀なexo-glycal構造の形成機構を明らかにしたものとして重要である。これらの成果をまとめて、The Journal of Antibiotics誌で発表した。別の核酸系天然化合物であるA-94964の立体化学については、国際共著として発表することができた。

staurosporine / rebeccamycin / Streptomyces / 二次代謝産物 / 生合成 / 遺伝子 / 放線菌 / インドロカルバゾール

インドロカルバゾール骨格を有する天然化合物は、放線菌由来の産物を主として多数報告されている。強力なプロテインキナーゼ活性を有するスタウロスポリン(STA)やDNAトポイソメラーゼ阻害剤であるレベッカマイシン(REB)など多くの興味深い生理活性物質が存在するために、医薬品などへの産業利用が期待される化合物群である。その生合成経路については、これまでほとんど知られていなかったが、近年、我々のグループの他、複数の欧米グループの精力的な研究により生合成機構の全貌が遺伝子レベルで明らかになった。これらの成果によってコンビナトリアル生合成を用いた新規アナログ創製法なども実現しつつあり、インドロカルバゾール医薬品の創製等が期待されるまでになっている。
本研究では、インドロカルバゾール骨格の生合成に関与するユニークな酵素群の反応機構の解明について行った。
(1)クロモピロリン酸合成酵素
STA生合成経路において、IPAよりCPAを生成する酵素・StaDは既知蛋白とのアミノ酸配列上の相同性が見られないユニークな酵素である。我々は大腸菌を用いて活性型のStaD酵素発現を行い、4量体構造を取る巨大ヘモプロテインであることを明らかにした。
(2)本生合成に関与する2つのP450酵素
StaDによって生成するCPAはその後2段階の酸化反応を経てSTAアグリコンへと変換される。本酸化反応の詳細は未知であるが、StaC, StaPの2つの酵素が関与することが明らかになっている。このうち、StaPはP450酵素である。一方、STAアグリコンと糖部位は2ヶ所のC-N結合によって結ばれているが、このうちの1ヶ所はP450ホモログであるStaNが関与している。

放射菌 / ポリケタイド / 生合成 / 糖 / マクロサイクリック化合物 / 脱水酵素 / 放線菌 / 遺伝子

本研究では、放線菌Streptomyces versipellis 4083-SVS6株が生産するバーシペロスタチン(VST)の生合成遺伝子のクローニングとその精密機能解析を通して、VSTの生合成機構を解明することを目的としている。VSTはI型ポリケタイド合成酵素で合成される既知の化合物とは構造が異なり、α-アシルテトロン酸構造を含む17員環マクロサイクリック化合物である。よって、α-アシルテトロン酸構造を形成するための生合成遺伝子群の取得、およびその生合成機構の解明により、I型ポリケタイド合成酵素で合成される化合物の新たなスターターユニットとその生合成遺伝子が解明され、新たな改変可能なα-アシルテトロン酸構造が加えられることになると考えられる。VSTの生合成遺伝子をクローニングするため、エリスロマイシンやエバーメクチンの生合成遺伝子中で特に保存されているケト体合成酵素(KS)とアシル基転移酵素(AT)の領域を含むPCR用プライマーを用い、VSTの生合成に関与するKSとATの領域を4083-SVS6株からクローニングした。塩基配列を決定した結果、少なくとも5種類のKS-AT領域の配列が含まれていることが判明した。ついで、VSTはdigitoxoseとcymaroseを含んでいるため、これらの糖の生合成に共通の酵素と考えられるdTDP-glucose-4,6-dehydrataseをクローニングするためのPCR用プライマーを設計し、4083-SVS6株からクローニングを試みた。その結果、予想通り495bpの大きさのDNA断片が増幅され、その塩基配列を決定したところ、その他の放線菌からクローニングされているdTDP-glucose-4,6-dehydrataseと70%から80%の相同性を示すことが明らかとなった。今後は、これらKS-AT領域とdTDP-glucose-4,6-dehydrataseを含む2つのDNA断片をプローブとして用いて、4083-SVS6株のコスミドライブラリーの中から陽性クローンを選択することにより、VSTの生合成遺伝子クラスターを取得する。

staurosporine / rebeccamycin / Streptomyces / 二次代謝産物 / 生合成 / 遺伝子 / 放線菌

インドロカルバゾール誘導体の創製とその生理活性
レベッカマイシン、スタウロスポリンはLechevalieria aerocolonigenes ATCC39243及びStreptomyces sp. TP-A0274株が生産するインドロカルバゾール化合物である。これら生産菌より生合成遺伝子をクローニングし、組換えることにより非天然型インドロカルバゾール化合物の生産を行った。現在までに15種類の化合物の生産に成功した。このうち、CCAはHuman DNA topoisomeraseI及びIIに対して阻害効果が見られた。また、staN破壊株が生産するHolyrine AはHuman U937 cellに対して0.2mMの濃度でアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。
新規トリプトファン水酸化酵素遺伝子tox1の機能解析
複素環化合物を直接水酸化することは、従来の有機合成的手法では困難である。他方、Streptoverticillium sp. BA13793株は、インドール環の7位に水酸基を持つインドロカルバゾーノレ(IC)化合物BE-13793Cを生産する。そこでBE-13793Cの生合成遺伝子クラスターから新規トリプトファン水酸化酵素遺伝子をクローニングし、その遺伝子を発現させ、機能解析を行った。
tox1は1,566塩基からなる新規水酸化酵素遺伝子であり、スタウロスポリンのアグリコンを生産するStreptomyces lividans pTYMC sta7株に導入したところ、スタウロスポリンのアグリコンの10位が水酸化された化合物を産生した。