Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

フェロモン / 生体分子 / 牛 / 獣医学 / 繁殖学

本年度は実施計画に基づいて研究を実施し，以下の成果を得た。
①　バイオアッセイ系の確立
★鋤鼻器スライス標本による受容体の特定：現在報告されている牛の鋤鼻1型受容体（V1R）43種のうち，偽遺伝子化していないと推定された25遺伝子についてプローブを作製し，雄効果フェロモンを含有すると考えられる雄牛被毛を呈示した雌牛の鋤鼻器の凍結切片でin situ hybridizationとS6リボソームタンパク質のリン酸化を標的とした免疫染色を行ったところ，6種のV1Rプローブにて二重陽性細胞が観察された。pS6陽性細胞数に対するV1RとpS6の二重陽性細胞数の割合は，合計52.6％であった。★受容体強制発現系を用いたin vitroバイオアッセイ：HEK293細胞や牛鋤鼻器由来細胞株にウシV1Rの導入を試みたところ，前者では16種，後者では8種のV1Rが発現し，細胞膜に移行することが確認された。★黄体形成ホルモン（LH）パルスを指標としたin vivoバイオアッセイ：本年度も卵巣除去雌牛を確保できなかったため，発情周期を同期化して，条件検討を継続した。本年度は，黄体期の雌牛（7頭）に，空袋を呈示する“対照区”，袋に去勢雄牛被毛を入れて呈示する“去勢雄牛被毛区”，雄牛被毛を入れて呈示する“雄牛被毛区”，後述する候補リガンドカクテルを呈示する“カクテル区”を設定し，10分ごとの採血をそれぞれ12時間に渡って実施した。その結果，“雄牛被毛区”と“カクテル区”では，提示前に比較して呈示後のLHパルス頻度が高まる傾向のあることが明らかとなった。
②　リガンド分子同定
昨年度より継続して雄牛被毛と去勢雄牛被毛についてGC/MSで分析・比較したところ，量の異なる物質が存在することが判明し，一部（29成分）をフェロモン候補リガンドとしてリストアップし，合成物質を入手して候補リガンドカクテルを作製した。

フェロモン / 生体分子 / 牛 / 獣医学 / 繁殖学

本年度は実施計画に基づいて研究を実施し、以下の成果を得た。
①雄牛フェロモン活性に対するバイオアッセイ系の確立
鋤鼻神経細胞を用いた生物検定：2年6か月齢の交雑種雌牛の鋤鼻組織から確立した不死化細胞100個以上のクローンからのtotal RNA抽出とcDNA合成を完了した。鋤鼻神経細胞のマーカーであるolfactory marker proteinおよびG protein（Gi）を発現する細胞を検索し、35個のクローンを得た。受容体強制発現系を用いた生物検定：フェロモン受容体の膜発現を実現するため、腎臓由来の細胞株を用いて繊毛発現シグナルの検討を行った。LHパルスを指標とした生物検定：農研機構畜産研究部門において、卵巣除去牛にエストロジェンのインプラントを投与後LHパルスを観察し、フェロモン検定のためのモデルを検討した結果、エストロジェン投与後徐々に負のフィードバック効果が薄れていくことを明らかにした。MUA記録システムを用いた生物検定：農研機構畜産研究部門の牛脳定位固定装置を用いて3頭の雄牛の弓状核に電極を植え込み、東京大学附属牧場にて電気活動を記録することができた。現在LHパルスと同期するMUAボレーは得られていないが、術技と記録法を確立することができた。
②雄牛フェロモンのリガンド分子同定
現時点では雄牛フェロモンの産生部位が特定できていないため、農研機構畜産研究部門において雄牛頭部のヘッドスペース捕集方法の改良を行うとともに、1歳における雄牛去勢前後のサンプルについて比較を試みたところ、精巣由来アンドロジェン依存性のピークが複数存在することが明らかとなった。

フェロモン / 生体分子 / 牛 / 獣医学 / 繁殖学

牛乳は国民の健康に欠かせない重要な生鮮食料品であるが, 牛乳を生産する乳牛の繁殖障害は年を追うごとに深刻化しており, その克服が喫緊の課題となっている。本研究では, 従来のホルモン等を用いる方法に代わる新たな乳牛の繁殖障害の治療・予防手段を開発することを念頭に, フェロモンを活用するための基盤研究として雄牛フェロモン(Bull Pheromone)の同定を目指す。すなわち本研究の目的は, 雌牛の性腺機能を刺激する雄牛フェロモンの単離精製と構造決定である。さらには天然フェロモンの分子構造に関する情報をもとに人工フェロモンを合成し, 乳牛の繁殖障害に対するフェロモンを利用した新たな予防・治療技術の開発につながる基礎情報を収集する。
本研究期間においては, 上記目的に照らし合わせ, 雄牛フェロモンの存在が想定される雄牛の被毛を採材した。具体的には, 雄牛が存在する家畜改良センター新冠牧場(ホルスタイン種)と岐阜県畜産研究所(黒毛和種)に研究分担者(前者 : 武内)か連携研究者(後者 : 前多)が訪れ, 被毛の採材方法を指導したのち, 現地で採材した被毛を冷凍保存して郵送していただいた。被毛については, 頭頚部と躯体部に分けて採材を行い, 頭頚部についてはフェロモン存在部位として, 躯体部についてはコントロール部位として今後の研究に使用することとした。なお, 本研究開始後に基盤研究(S)「雄牛フェロモンの同定と実用化に関する研究」が採択されたため, 本研究課題内容についてはそちらで継続することとした。

【研究分担者】
大蔵聡	名古屋大学	生命農学研究科	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
武内ゆかり	東京大学	大学院農学生命科学研究科(農学部)	教授	(Kakenデータベース)
松山秀一	国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構	畜産研究部門	主任研究員	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
武内ゆかり	東京大学	大学院農学生命科学研究科	准教授	(Kakenデータベース)