【研究分野】薬理学一般

【研究領域課題番号】15390079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小脳 / プルキンエ細胞 / イノシトール三リン酸 / カルシウム / LTD

【研究成果の概要】

小脳の平行線維・プルキンエ細胞シナプスにおける長期抑圧現象(LTD)は、運動学習の電気生理学的素過程であり、その解明は特に重要である。LTDには、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール三リン酸(IP_3)の関与が示唆されてきたが、詳細は明らかにされていない。本研究では、IP_3の小脳プルキンエ細胞における細胞内動態がLTDの誘発に深く関わると考え、この点にアプローチした。我々は、細胞内IP_3の時空間的動態を可視化する蛍光プローブGFP-PHDを開発しているが、これを応用し、プルキンエ細胞内のIP_3動態が平行線維、登上線維によってどのように変化するのかを解析した。2光子励起顕微鏡を利用しスライス標本においてGFP-PHDが発現するプルキンエ細胞のイメージングを試みた。その結果、微細な樹状突起におけるIP_3濃度変化をイメージングすることが可能になり、平行線維刺激で誘発されるIP_3上昇を世界に先駆けて直接測定することに成功した。グルタミン酸受容体としてはイオン透過型(iGuR)と代謝型(mGuR)が知られている。IP_3産生を担うと考えられていたmGluRに加え、iGluRが平行線維刺激によるIP_3産生に重要な役割を果たすことを発見した。その他の解析から、平行線維入力によるIP_3産生には、mGluR、iGluRともに重要であり、それぞれ、GTP結合蛋白質、カルシウム流入依存性の機構を介し、協調的に働くことが結論された。この成果は、LTD制御におけるIP_3の時空間的な役割の理解を大きく前進させるものと考えられる。また、本研究に必要な周辺技術基盤の構築にあたり、RNAiライブラリーの構築法、これに基づくIP_3受容体の高効果ノックダウン技術などを確立することができた。これら技術はLTDの分子機構解明のみならず、関連他領域にとっても重要な影響をもたらす成果であろうと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】15,200千円 (直接経費: 15,200千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】13854028 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

逆行性シグナル / カンナビノイド / シナプス伝達 / 小脳 / 海馬 / カルシウム / CB1受容体 / Gq結合型受容体 / シナプス伝達調節 / 大脳基底核 / フォスフォリパーゼCβ / 代謝型グルタミン酸受容体

【研究成果の概要】

マリファナの活性成分であるΔ9-テトラヒドロカンナビノールは、中枢神経系に広く分布するCB1カンナビノイド受容体を介して作用を発現する。CB1受容体に対する内因性のリガンド(内因性カンナビノイド、以下eCBと略す)の候補として、アナンダミドと2-アラキドノイルグリセロールがある。CB1は中枢ニューロンのシナプス前線維に局在し、その活性化によって伝達物質放出の減少が起こる。しかし、本研究開始時点で、eCBがどのような刺激によって生成され、どのような生理機能を果たすかという最も重要な点についてはほとんど明らかにされていなかった。本研究では、eCBのシナプス伝達における役割を主として電気生理学的手法を用いて調べ、以下の結果を得た。
海馬神経細胞および小脳プルキンエ細胞において、シナプス後細胞の脱分極と細胞内Ca^<2+>濃度上昇によりeCBが放出され、逆行性に抑制性および興奮性シナプス終末のCB1受容体に作用して伝達物質放出の一過性減少がおこることを明らかにした。また、グループI代謝型グルタミン酸受容体や、M_1及びM_3ムスカリニックアセチルコリン受容体などのGq結合型受容体の活性化によってeCB放出が起こり、逆行性にCB1受容体に作用して伝達物質放出の一過性減少がおこることを発見した。さらに、海馬培養細胞において、単独ではeCB放出を起こさない程度の弱いM_1/M_3受容体の活性化と弱い脱分極を同時に与えると、eCBが効率よく産生された。これは、海馬神経細胞に存在するフォスフォリパーゼCβ1(PLCβ1)の酵素活性が、M_1/M_3受容体の活性化と細胞内Ca^<2+>の両方に依存することが原因である。したがって、PLCβ1はコリナージック入力(シナプス前活動)と細胞内Ca^<2+>濃度上昇(シナプス後神経活動)の同期性検出分子として機能することが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2001 - 2004

【配分額】104,520千円 (直接経費: 80,400千円、間接経費: 24,120千円)

【研究分野】薬理学一般

【研究領域課題番号】13470019 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小脳 / プルキンエ細胞 / イノシトール三リン酸 / カルシウム / リアノジン / イノシトールリン脂質

【研究成果の概要】

本研究の目的は、小脳プルキンエ細胞においてIP_3をイメージングし、LTD誘発機構におけるIP_3の役割を時間的および空間的コンテクストにおいて明らかにすることである。この目的のため、平成13年度には、主に培養細胞系を用いたマウス小脳プルキンエ細胞でのIP_3イメージングに関しての基礎的な実験を整備し、平成14年度においては、IP_3とLTDとの関連について明らかにしていくために、高解像度のIP_3イメージングをスライス標本で行う実験を行った。IP_3イメージングのためのプローブは、我々の開発したGFP-PHD(グリーンフルオレセント蛋白(GFP)とホスホリパーゼCδ1のPHドメインの融合蛋白)であるが、このGFP-PHDのcDNAを乗せたSindbisウイルスベクターを直接生きたマウスの脳に注入することによって、高効率にIP_3イメージングプローブ蛋白をプルキンエ細胞内で発現させることに成功した。この実験系を用いて、イオンチャネル型グルタミン酸受容体のアゴニストAMPAによるIP_3産生現象が、単に薬理学的なepi-phenomenonではなく、生理的刺激によっても誘発されうることを見出した。これらの知見は従来の考え方を覆す知見であり、LTD現象へのIP_3の関わりの実像について意外な一場面が見えてきたものと考えられる。さらにIP_3の関わりを明らかにする為のツールである幾つかの新規化合物についてその評価を行い、さらに詳細なメカニズムの解明へ向けた準備が整いつつあり、本研究の成果で得られた新たなパラダイムのもとにさらに研究を進めることがLTD解明にとって重要であると考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】14,300千円 (直接経費: 14,300千円)

【研究分野】神経・筋肉生理学

【研究領域課題番号】05780615 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カルシウム / 画像処理 / シナプス / グルタメイト / 小脳

【研究成果の概要】

シナプス前終末のカルシウム濃度測定の対象として、当初鶏胚の杯型神経節を用いたが、色素の退色が早く、ラインスキャンによるアベレイジは有効でなく、また、標本を準備するのに手間が懸かりすぎるなどの問題があった。そこで、申請者は培養神経細胞において、カルシウム画像処理ができる系を探した結果、小脳の培養細胞においてとりわけ大きな終末が多数観察されることを発見した。それらが、シナプス終末であることは、シナプス後細胞がある場合にはその終末の刺激でシナプス電位が記録されること、またシナプス後細胞の無い場合でも、脂溶性の蛍光色素、FM1-43、を用いることにより機能的に同定された。また、それらの終末は解剖学的にもシナプトフィジンやシナプシンを持っていることが示された。この大きな(2-4 ミクロン)終末の一部はプルキンエ細胞の軸索終末であり、また他の一部は苔状繊維の終末であると考えられた。更に、カルシウム蛍光色素フラレッドを負荷することによりカルシウム画像処理を行うことが可能であることがわかった。予想されたようにこのシナプス終末は脱分極により強いカルシウム上昇を示した。しかし、シナプス後部と異なりグルタメイト、アセチルコリン、アデノシン三燐酸などのカルシウム動員性のアゴニシトではカルシウムが全く上昇しないことがわかった。一方、アラキドン酸はこのシナプス前終末に強いカルシウム動員作用をもつことが見出だされた(論文準備中)。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1993

【配分額】1,200千円 (直接経費: 1,200千円)