【研究領域課題番号】22K19266 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質結晶 / 構造解析 / 小角散乱 / 結晶化機構

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2022-06-30 - 2024-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究領域課題番号】19H02830 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質結晶 / タンパク質集合体 / 細胞内結晶化 / タンパク質工学 / 結晶構造解析 / 多角体 / 構造解析 / クリスタルエンジニアリング

【研究成果の概要】

結晶化機構の解明には、結晶を構成する蛋白質単量体間の相互作用の理解が重要である。異なる種の多角体結晶構造の比較から申請者はいくつかの領域が多角体ウイルスの内包に関わる領域であり、結晶化に必須の相互作用を有する領域ではないと考えた。研究代表者は各領域を遺伝子工学的に欠損させた変異多角体を作成し、単量体あたり8残基から50残基の欠損部位を有する変異多角体を作成し、その機能を設計した。

【研究の社会的意義】

細胞を反応容器とした目的タンパク質の自在な結晶化手法を確立することができれば、有用タンパク質材料の機能化・合成・構造決定を細胞内のみで一貫して達成することが可能となり、基礎研究から社会実装まで、医薬品を中心とするバイオ分野に大きな波及効果を及ぼす技術につながる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】10558106 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

電子線回折 / 結晶解析 / 構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / 低温試料ホルダー / 蛋白質結晶 / データ収集

【研究成果の概要】

本研究では、X線結晶解析にかからないような薄い結晶からでも蛋白質の構造決定を行えるよう、電子線回折用回転カメラとその関連技術の開発を目標とした。生物学的に重要な膜蛋白質では特に数層しかない結晶が得られることも多いからである。この目的のために、(i)既存の電子顕微鏡の大幅な改造、(ii)コンピューター制御ソフトウェアの開発、(iii)高傾斜角低温試料ホルダーの開発を行った。また、同時に、電子線回折パターンの指数付、反射点の積分強度の計算回折強度のスケーリングのためのソフトウェアの開発も行った。このような開発は、数層から成る結晶の場合、X線回折にはかからないことと、回折パターンは三次元結晶からのものとして扱わなければならないが既存のX線結晶解析用ソフトウェアでは処理できないためである。
回転カメラの最初のものは、DCモーターと内蔵ロータリーエンコーダー、スロースキャンCCD検出器を用いて実現された。これは、大幅な改造を必要とするわけではないので、現代の電子顕微鏡の大部分のものに設置可能である。このシステムの性能を検定するため、カルシウムATPaseの超薄結晶に適用し、傾斜角±30°までのデータを収集した。本研究で開発した「最低電子線量電子線回折法」を用いることにより、100枚もの回折パターン(回転写真)を同じ結晶から得ることが出来るようになった。さらに精度を上げるために、第2のものを作製した。これはハイデンハイン社の高精度ロータリーエンコーダーとパルスモーターを用いたものである。ハードウェアは完成したが、制御ソフトウェアは未完成の部分を残している。しかしながら、これまでに得られた予備的結果は大変期待が持てるものである。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】11,400千円 (直接経費: 11,400千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】05508004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

電子顕微鏡 / 蛋白質結晶 / 電子線回折 / 氷包埋法 / 構造解析 / 電子線損傷 / クライオトランスファー / 結晶解析 / 電子線回析 / 低電子線量法 / CCDカメラ / 電子線 / 三次元構造解析

【研究成果の概要】

本年度は、昨年度の結果をふまえて、電子顕微鏡の仕様を決定し、数多い改造を含め、実際に電子顕微鏡の製作を行った。実験としては、低電子線量法の改良と、クライオトランスファーの最適化のための真空系の見直しに特に重点を置いた。
実際の蛋白質結晶の観察にあたっては、氷包埋試料を用いるため、電子線損傷の最小化と、試料の汚染を防止することが極めて重要になる。低電子線量法では、電子線回折との有機的結合をはかるとともに、傾斜試料のために多点でフォーカスを合わせられるようにした。また、これまで目的とする領域に不必要な電子線が照射されるのを防ぐためには、ビームを振ることによって逃げていたが、電子銃のバイアス電圧や、フィラメント電流を変化させる方法も検討した。その結果、電子銃のバイアス電圧を変える方法が使え、ビームを振る方法よりも優れている可能性があることが判明した。一方、氷包埋試料の観察の最適化のために、クライオトランスファー時の霜の発生を防ぐシールドの開発を行うとともに、試料汚染防止装置の効果の検証、ドラッグポンプを用いた粗引真空系の最適化を図った。実際、配管材料等を見直すことにより、これまでよりも2ケタ良い真空度を得られることがわかった。このことは、フィルムから発生する水蒸気による試料の汚染を防ぐのに大きな効果があるはずである。
数多くの改良によって、蛋白質結晶の構造解析のために最適化された電子顕微鏡をつくりあげることが出来たが、電子線回折パターンの収集は、非常に限られた予算のために満足できる結果が得られたとは言い難い。

【研究種目】試験研究(A)

【研究期間】1993 - 1994

【配分額】43,000千円 (直接経費: 43,000千円)