【研究領域課題番号】19K22466 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝学的ツール / オーキシン誘導デグロン法 / 神経細胞 / 遺伝子発現制御 / プロテインノックダウン / ユビキチンプロテアソーム / ユビキチン・プロテアソーム分解 / タンパク質分解 / 遺伝子発現

【研究成果の概要】

タンパク質の発現レベルの制御は、生体におけるタンパク質の機能解析において有望なアプローチである。オーキシン誘導性デグロン法は、真菌や哺乳類の有糸分裂細胞において標的タンパク質を迅速かつ可逆的に分解することが明らかになっている。本研究では、この技術が神経系に応用できるかどうかを検討した。その結果、in vivoおよびin vitroの両条件下において、植物ホルモンであるオーキシン依存的に標的タンパク質を数十分という単位で迅速に分解できることを発見した。これにより、特定の時間枠に限定したタンパク質ノックダウンが可能となり、神経系におけるより詳細な遺伝子機能解析が行われることが期待される。

【研究の社会的意義】

本申請課題では、植物細胞において生じる植物ホルモン依存的なタンパク質分解が、哺乳類の神経細胞において遺伝学的ツールとして移植可能であるかを検証した。その結果、神経細胞の培養系(in vitro)及び動物個体(in vivo)の両条件において、植物ホルモン依存的に数十分という時間スケールで神経細胞内で発現する標的タンパク質をノックダウンできることを明らかにした。これにより、特定の時期特異的なタンパク質の機能解析が可能となり、神経科学における遺伝子機能解析の研究が飛躍的に進むことが期待される。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2019-06-28 - 2021-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究領域課題番号】18H03940 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

植物 / 硝酸応答 / 遺伝子発現 / シグナル伝達 / 窒素栄養 / 硝酸シグナル / 転写因子 / 窒素応答 / 遺伝子発現制御 / 窒素 / 栄養応答 / 栄養シグナル / 転写カスケード / 窒素代謝 / NLP転写因子

【研究成果の概要】

硝酸応答を担うNLP転写活性化因子が直接、発現を誘導する遺伝子として新たにホメオドメン-ロイシンジッパー型（HB）転写因子遺伝子を同定した。このHB転写因子の機能欠損変異株は斑入りの表現型を示し、また、この機能欠損変異株の葉肉細胞の多くで葉緑体の発達の異常が起こっていることを明らかにした。さらに、HB転写因子の欠損変異体のトランスクリプトーム解析により、HB転写因子は葉緑体の発達や機能維持に関わる多くの遺伝子の発現制御に関わっていることを明らかにした。HB転写因子の機能欠損変異株で最も発現が低下している遺伝子の一つがVAR2遺伝子であったが、var2変異体は斑入りの表現型を示すことが知られていることから、HB転写因子がVAR2遺伝子を直接制御している可能性をクロマチン免疫沈降法などにより検討し、硝酸イオン-NLP-HB-VAR2という制御経路が存在することを明らかにした。VAR2遺伝子産物は葉緑体に局在するFtsHプロテアーゼのFtsH2サブユニットであり、FtsHプロテアーゼは、過剰な光エネルギーにより損傷を受けた光化学系IIのタンパク質などのチラコイド膜結合型の光合成関連タンパク質の除去を担い、光化学系II修復サイクルの中心因子として働いている。そこで、強光条件及び強光かつ低窒素条件で、HB転写因子の欠損変異体や過剰発現株の表現型解析を行い、硝酸シグナルがNLPとHB転写因子を介してVAR2の発現を促進することで強光環境でより多くの光エネルギーを利用することを可能としていることを明らかにした。一方で、NLP転写活性化因子により直接、発現が誘導されるNIGT1転写抑制因子の直接の標的遺伝子としてDof型転写因子遺伝子を同定した。このDof型転写因子の欠損株の表現型解析を行い、このDof型転写因子も窒素欠乏応答に関わっていることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】43,680千円 (直接経費: 33,600千円、間接経費: 10,080千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】15K15484 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現制御 / 光遺伝学 / Phytochrome B / 光受容体 / 癌 / ルシフェラーゼ / がん / 光制御 / 遺伝子発現 / 膵癌

【研究成果の概要】

膵癌は早期発見が困難であり、予後が極めて不良な疾患であることから、より優れた治療法の開発が急務である。本研究は、光照射により遺伝子発現制御が可能な「光スイッチシステム」を作製し、膵癌の遺伝子治療法の開発を目指すことを目的として研究を行った。植物の光受容体フィトクロムBとその結合タンパク質(PIF6)の赤色光照射による結合が転写活性化スイッチとなり、近赤外光で転写が抑制されるベクターを作製した。このシステムは癌治療への応用に向けた生物学的なプロセスにおける転写調節への適用が期待される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】26291056 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Arabidopsis / leaf development / linc RNA / AS2 and AS1 / gene body methylation / DNA methylation / nucleolar bodies / epigenetics / ノンコーディングRNA / AS1-AS2 / 遺伝子発現制御 / 葉分化 / シロイヌナズナ / 発生・分化 / 遺伝子発現 / 小分子 RNA / 遺伝子発現機構

【研究成果の概要】

我々はAS2と長鎖ノンコーディング（linc）RNAを基軸としてシロイヌナズナの葉の表・裏が形成される仕組みを研究したが、linc RNAの同定は不成功だった。一方、linc RNA と関連している次の様な研究が進んだ。1. AS2 は核小体近傍で顆粒（AS2 body）を形成する。AS2のCxxC ジンクフィンガー様配列（ZFL 配列）は、AS2 body形成と葉の発生に必要だった。2. AS2 はZFL配列依存的に標的遺伝子であるETTのエキソン1に結合した。3. ETTのエキソン6にあるCGは90%以上メチル化されていた。AS2と3つの核小体蛋白質はCG のメチル化の維持に必要だった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2018-03-31

【配分額】15,860千円 (直接経費: 12,200千円、間接経費: 3,660千円)

【研究分野】植物栄養学・土壌学

【研究領域課題番号】25252014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

植物 / 硝酸シグナル / シグナル伝達 / 転写因子 / 遺伝子発現制御 / 植物栄養 / 硝酸応答 / 転写制御 / 窒素 / 遺伝子発現

【研究成果の概要】

植物の窒素栄養環境への適応において硝酸応答型の遺伝子発現は中心的な役割を担う。この硝酸応答型遺伝子発現を担う転写因子はNLPタンパク質群であることを同定していることから、NLP転写因子群を手がかりに、モデル植物であるシロイヌナズナを用いて硝酸応答型遺伝子発現の制御機構の解析を行った。DNAマイクロアレイ解析によって、NLP転写因子群は硝酸応答型遺伝子発現のほとんどを制御しているマスターレギュレーターであることを明らかにした。また、硝酸シグナルの伝達に応答してNLP転写因子群がリン酸化されることが、NLP転写因子の活性化機構であることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2013-05-31 - 2017-03-31

【配分額】45,890千円 (直接経費: 35,300千円、間接経費: 10,590千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】25282229 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現制御 / 光受容体 / オプトジェネティクス / BLUF / 遺伝子発現 / 光遺伝学 / 転写制御

【研究成果の概要】

青色光受容体PixDを利用して、任意の遺伝子の発現を光制御する方法の構築を目指した。クロスリンクと質量分析によりPixDのダイマーの予想構造を得た。この情報を利用し、先に開発したPixDによる転写因子光制御法PICCOROの改良を進め、植物の花の形成を司る転写因子AGAGOUSの制御を試みた。PixDを恒常的に発現するシロイヌナズナを複数ライン単離することに成功した。またPixEのPixD相互作用部位をドミナントネガティブ型AGAMOUSに融合した。この融合したコンストラクトを、上記PixD発現シロイヌナズナに導入し、そのホモラインを複数ライン単離することに成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】25290063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発声学習 / 学習臨界期 / ソングバード / 自発的行動 / 自発的学習 / 遺伝子発現制御 / エピジェネティクス / 遺伝子発現 / 神経可塑性 / 感覚運動学習 / 次世代シークエンス / 発声行動 / 時空間制御 / DNAメチル化 / 神経活動依存的遺伝子発現

【研究成果の概要】

鳴禽類の囀りはヒトの言語獲得と同様に、学習臨界期をもつ発声学習によって獲得される。しかし、その発声学習臨界期を制御する神経メカニズムの理解は進んでいない。本研究では、鳴禽類の一種zebra finchを用いて、学習臨界期中の発声練習を阻害することで、正常個体で学習臨界期が終了している成鳥時においても発声学習能していることを見出した。この日齢非依存的な発声学習能は、哺乳類運動野第5層に相当する神経細胞において誘導される70個にも上る神経活動依存的な遺伝子群の発現誘導能と強い相関が見られた。その発現誘導能がいかに制御されるか、DNAメチル化、ヒストン修飾制御の観点からの検証実験が必要である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】18,330千円 (直接経費: 14,100千円、間接経費: 4,230千円)

【研究分野】医薬分子機能学

【研究領域課題番号】08457623 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現制御 / 金属錯体 / 錯体化学 / 核酸 / 遺伝子発現 / 分子認識 / 錯体合成 / 転写調節領域 / チミン塩基 / 塩基対認識

【研究成果の概要】

チミン塩基に選択的に結合する亜鉛サイクレン錯体と、ウイルスDNAの転写領域に存在するTATAboxを含む19mer二本鎖DNAをはじめとする、数種の直線型およびヘアピン型オリゴマーDNAとの相互作用を詳細に調べた。ATリッチな配列を含む二本鎖DNAオリゴマーに対して亜鉛錯体を添加すると、濃度依存的にDNA二本鎖構造体が不安定化し、その融解温度が低下することが判明した。一方、銅およびニッケル錯体の場合には、融解温度の上昇が観察され、融解温度の低下は亜鉛錯体に特異的な現象であることが明らかとなった。AT塩基対の割合が異なる二本鎖DNAオリゴマーについても同様の融解実験を行い、亜鉛錯体のATリッチな二本鎖DNAに対する特異性が明らかになった。また、融解が起こらない温度における軽水中のイミノプロトンNMRの結果も、亜鉛錯体の添加によりAT塩基対の解離が誘起されることを強く支持した。一般的に、二本鎖DNAの核酸塩基に結合する化合物は、塩基対を解離させ融解温度を低下させることが知られている。亜鉛錯体もチミン塩基に結合することにより、二本鎖構造を不安定化していると考えられた。生体内では大きな蛋白質が複雑に集まってDNAをほぐしその情報を引き出しているが、本研究は人工の小さな化合物が遺伝子を活性化できる可能性を示している。また、本研究では、どのような塩基配列に対しても相補的に結合できる自己集合型アンチセンス人工DNAを構築することを目的とし、核酸塩基および二つの金属結合部位を分子内に有する4種類(それぞれA、T、G、Cに対応する)のモノマーを合成した。本法は、一本鎖DNAを鋳型とする機能性分子の配列制御や、二本鎖核酸を鋳型とするロタキサン型大環状リングの構築にも展開できる適用性の高いものである。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,200千円 (直接経費: 7,200千円)

【研究分野】植物栄養学・土壌学

【研究領域課題番号】07456037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現制御 / メクロチオネイン / 形質転換植物 / ホウ素 / イオウ / 栄養欠乏 / シロイヌナズナ / 変異株 / 遺伝子発現 / 栄養診断 / ディフレンシャルディスプレイ / 植物栄養 / 微量要素

【研究成果の概要】

これまでの研究は、主に様々な濃度のホウ素イオンや硫酸イオン濃度で成育させた植物よりmRNAを抽出し、これらとコントロールの植物より抽出したmRNAをもちいて、DO(ディフレンシャルディスプレイ)法による遺伝子断片の単離を目指してきた。また、特にイオウ応答プロモーターの解析によるイオウ欠乏症状の迅速な検出法の確立を目指してきた。これまでに、過剰のホウ素イオン存在下で成育させた植物中で発現が抑制される遺伝子断片が得られた。この遺伝子の塩基配列を決定したが相同性のある遺伝子は知られておらず、機能の推定には至っていない。しかしながら塩基配列の情報を基に、RT-PCR用のプライマーを合成できた。ノーザンハイブリの結果より、確かにこの遺伝子は、ホウ素イオンにより遺伝子発現が調節されていることが確認された。したがって、合成したプライマーを利用して、さまざまな地域から採取してきた植物が、どのようなホウ素栄養下で生育してきたものであるかを知る手がかりができた。また、砂地などホウ素が欠乏しやすい土壌で生育している植物における本遺伝子の発現状況をRT-PCRで簡便に確認することで、植物がおかれている栄養状況を知り、さらに適切な施肥をおこなうタイミングを知ることができるようになる。イオウ欠乏症状検出系には、イオウ欠乏応答性のプロモーターの単離とこのプロモーターにGUS遺伝子を連結して作成した遺伝子で形質転換した植物を使用できるようになった。作成した形質転換植物を利用することがイオウ欠乏の程度を簡単な染色により検出できる系が確立できる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】6,900千円 (直接経費: 6,900千円)