Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

ES細胞 / アルツハイマー病 / ノックイン / 分化誘導 / 疾患モデル / 神経細胞

遺伝子ターゲッティング技術による家族性アルツハイマー病変異(V6421-APP)ノックインES細胞株の樹立と、ES細胞の高効率in vitro神経分化誘導法とを組み合わせることでアルツハイマー病の遺伝子型を有した高純度の神経細胞を培養皿の上に作成することに成功した。昨年度までの研究で、この神経細胞は野生型ES細胞由来の神経細胞と比較してアミロイドβ42の産生が亢進している、すなわちアルツハイマー病の表現型の少なくとも1つを有していることが明らかとなったが、今年度は更に、家族性アルツハイマー病変異導入に起因した神経細胞死の有無をTUNEL法により調べると共に、神経原繊維変化に関係したタウの過リン酸化の有無を、抗リン酸化タウ抗体を用いた細胞染色により検討した。
神経細胞死に関しては、最終分化誘導後1週目から3週目にかけて全細胞核(Hoechst 33258陽性)中のTUNEL陽性の核の割合を求めた。その結果、全細胞核中のTUNEL陽性の核の割合は野生型及びV6421-APPノックインにおいて同様のタイムコースで増加した。これは家族性アルツハイマー病変異導入に起因した神経細胞死は少なくとも最終分化誘導後3週目までは起こらないことを示唆している。
一方、タウのリン酸化は、胎児期にみられる生理的な過リン酸化が一過性に認められたが、神経原繊維変化に関孫したタウのリン酸化は最終分化誘導後6週目まで検出されなかった。
また、このアルツハイマー病モデル神経細胞をより疾患特異性の高いモデルへと改良するため、アルツハイマー病において選択的に変性する神経細胞群の一つである前脳基底部コリン作動性ニューロンへの高効率分化誘導法確立を目指した。この目的のため、choline acetyltransferaseのプロモータにEGFPを連結したトランスジーンを作成し、これを安定に導入したES細胞株を樹立した。

ドレブリン / シナプス / 老化 / アルツハイマー / 神経細胞 / 樹状突起 / development / aging

1. アルツハイマー病の脳の生化学的、組織化学的解析を系統的に行った。共同研究者のハタンパ博士はドレブリンが他のシナプス機能蛋白に比し、特異的低下を示すことを発見した。また、同時に正常の老化に従うドレブリン発現量の低下をヒト脳を用いて示した。また、ラット脳を用いてドレブリン含有シナブスの発生過程における変化を免疫組織化学的に解析した。生後0日から20日までのウイスターラットをホルマリン固定後、脳組織切片を作製し・ABC染色法および免疫蛍光染色を行った。生後10日齢以前ではドレブリンの分布には大きな変化はなく、細胞体,軸索,樹状突起でドレブリンが観察された。ところが14日齢ではドレブリンの局在は、既に樹状突起スバインに変化し、細胞体ではドレブリンは観察されなくなっていた。
2. 上記のドレブリン分布の変化が初代培養神経細胞においても観察されるかどうかを調べた。培養開始7日後:ドレブリンは突起に多く存在し、ドレブリン抗体により突起が連続性に染色された。また、細胞体ではドレブリンは細胞膜直下に集積していた。この時期には樹状突起スパインが形成され始めるといわれているが、ドレブリンの斑点状の集積はまだ観察されなかった。培養開始14日後:ドレブリンの染色像はほとんど斑状のものばかりとなるが、まだ細い突起は連続的に染まっている。培養開始21日後:ドレブリンの染色像は斑状のものばかりとなり、シナプトフィシン抗体との二重染色の結果から、ドレブリンの集積している場所は樹状突起スパインであることがわかった。以上より、ドレブリンの樹状突起スパインへの局在化はシナブスの機能成熟に一致して起こることが明らかとなり、神経活動依存的に局在化が起こる可能性が考えられた。

【研究分担者】
橋本祐一	慶應義塾大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
新倉貴子	慶應義塾大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
西本征央	慶應義塾大学	医学部	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
関野祐子	群馬大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)