Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

1分子計測 / RNA / １分子計測 / ダイナミクス / 過渡構造

2021年度は、RNA構造転移の測定法の１つとして、三重項－三重項エネルギー移動を利用した、RNA構造転移の測定法の開発に取り組んだ。一重項－一重項エネルギー移動であるFRETでは、一般にエネルギードナー、アクセプター間の距離が50Å程度以上変化する大きな構造転移の観測に優れている。これに対し、三重項－三重項エネルギー移動では、ドナー、アクセプター間の衝突が必要であるため、ドナー、アクセプターが衝突するRNAの分子運動に絞って追跡できる。ここで、1分子蛍光観察特有の現象であるblinkingを利用し、蛍光相関解析から三重項－三重項エネルギー移動が起こるのに要する時間（τT）を求める（1/τT はRNA分子運動速度に対応）。アクセプターとしては1,4,5,8-cyclooctatetraene（COT）を用いる。COTは、三重項－三重項エネルギー移動によりエネルギーを受け取り、100 μs以内にそのエネルギーを熱として放出し、蛍光分子の光安定性を向上させることが報告されている。蛍光分子としてATTO 647N、市販のCOTアミダイト誘導体を用いて、DNAをプラットフォームとしてblinkingにより三重項－三重項エネルギー移動の観測を試みたところ、τTがATTO 647NとCOT間の1本鎖DNAスペーサが長くなるほど長くなった。また、DNAスペーサがより柔軟なポリTの時に、より剛直なポリAと比べτTが長くなり、τTがDNAの1本鎖ダイナミクスにより起こるATTO 647NとCOTの分子衝突に要する時間を反映している、すなわち、τTの測定により核酸の構造転移を観測できることが示された。

RNA / 1分子計測(SMD) / ナノバイオ / イメージング / 細胞 / 蛍光プローブ / バイオイメージング / １分子計測(SMD)

本研究では独自開発したRNA標識技術mPUMテクノロジーを用いて、生細胞内RNAを1分子レベルから1細胞レベル、短時間の動態から長時間の可視化解析までを実現する分子ツール群の開発を目指した。1分子レベル・短時間の動態観察では二分割緑色蛍光タンパク質を用いたプローブを作製し、テロメア反復配列含有RNA(TERRA)と染色体テロメア領域、テロメア関連タンパク質の同時1分子追跡を実現し、未知の機能モデル構築に至った。1細胞レベル・長時間RNA可視化検出プローブとしては、二分割発光タンパク質を用いたプローブを開発した。本プローブを用いて1細胞解像度で数10分間のβアクチンmRNA可視化検出を実現した。

近年様々な細胞生理機能について、RNAの動態や局在の直接関与が知られている。一方生細胞内RNAの動態・局在の可視化解析法は極めて限られていた。また、RNAは遺伝子発現の一次産物であり、生細胞内RNAの可視化定量法開発はすなわち非破壊的な遺伝子発現解析法の創出と言える。本研究では独自に構築したmPUMテクノロジーを用いて、1分子解像度での生細胞内RNA動態解析から、数10分間にわたる1細胞解像度RNA可視化定量法を構築した。すなわち本研究の成果により、生細胞内のRNA機能について1分子単位・秒単位の現象から細胞ごとに特徴が現れる長時間の遺伝子発現までを可視化解析する分析技術群の構築が実現した。

遺伝子診断 / RNA / エピジェネティクス / １分子計測(SMD) / DNA / 1分子計測(SMD)

ターゲットRNAとプローブDNAのハイブリダイゼーションに加え、形成されるDNA/RNAハイブリッド構造の物性、すなわち、電荷移動特性を利用した1分子レベルRNA分析・診断法を開発した。電荷移動、電荷分離過程が蛍光の点滅（blinking）として観測されうることに着目し、暗状態の時間の長さ（OFF time）が、DNAの電荷移動特性を反映した電荷分離寿命（τ）と一致することを利用し、1分子レベルでDNA/RNAハイブリッドの電荷移動特性を調べ、RNA分析・診断へと応用した。

DNA / 一分子観測 / 生物有機化学 / 蛍光相関分光 / blinking / 三重項励起状態 / 遺伝子診断 / 一分子計測（SMD） / RNA / 蛍光 / FCS / モレキュラービーコン / 診断 / １分子 / 一塩基多型

様々な蛍光分子を種々の位置に修飾したDNAを化学合成し、蛍光相関分光（FCS）測定により、蛍光分子の発光挙動を1分子レベルで見たときに観測される発光の点滅（＝blinking）において蛍光分子が光っていない時間（＝OFF time）からモレキュラービーコンの1分子レベル観測を試みた。OFF timeは、蛍光分子が溶媒から遮蔽されて、蛍光分子の三重項励起状態と酸素の反応速度が遅くなるほど長くなることがわかった。これにより、蛍光分子をモレキュラービーコンのループ部位に導入することにより、検出したいターゲット鎖をblinkingの観測により1分子レベルで検出することに成功した。

【研究分担者】
田邉一仁	青山学院大学	理工学部	教授	(Kakenデータベース)