【研究領域課題番号】21H04952 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨再生 / 幹細胞 / 一細胞解析 / hPSCs / 骨誘導 / ヒト多能性幹細胞 / ゲノム編集

【研究成果の概要】

2021年度は当研究室で開発したヒト多能性幹細胞由来三次元骨組織を用いた解析を行った。まず、ヒト多能性幹細胞から椎板細胞（骨軟骨前駆細胞）へのStepwise分化誘導を行った。RT-qPCRにより誘導効率を確認した後、誘導細胞を免疫不全マウス腎被膜下へ移植し三次元骨組織を誘導した。骨組織はin vivoマイクロCTにより経時的に観察し、骨構造が十分に形成されたことを確認した。誘導骨組織は、異なる日数経過後に取り出し、10x Genomics社のChromium解析プラットホームを用いて、一細胞RNA-seq（Single Cell RNA-seq）解析を行った。具体的には、組織から酵素処理により細胞を単離した後、10x Genomics社のChromium解析プラットホームを用いて、一細胞ごとに分子バーコードを付加した後、cDNA逆転写反応とDNAライブラリーの構築、および次世代シーケンサーNova-seqを用いたシークエンスを行った。得られたシークエンスデータに対して、東京大学医科学研究所スーパーコンピューターShirokaneを用いたバイオインフォマティクス解析を行った。Cell Rangerを用いてリファレンスゲノムGRCh38へマッピングした後、正規化・クラスタリングおよび次元圧縮解析により、類似の遺伝子発現により特徴づけられる細胞集団を同定した。既知の細胞分化マーカーやデータベースを参照し、各細胞集団のcharacterizationを行った。その結果、マウス由来の血球系細胞集団と、ヒト由来の骨格系組織が得られたことが確認できた。以上より、本手法により得られた骨組織はヒト骨格系細胞集団とマウス血球系細胞のキメラ構造を有していることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2021-04-05 - 2025-03-31

【配分額】40,950千円 (直接経費: 31,500千円、間接経費: 9,450千円)

【研究領域課題番号】20H03826 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮 / 幹細胞 / ゲノム編集 / 再生医学 / 光制御

【研究成果の概要】

令和3年度は，これまでわれわれが行ってきた部分的な子宮の再生・再建の技術と基盤知見をもとに，ラットを用いて子宮機能の中心的な役割を担う子宮内膜の全層再建・再生技術の開発を行った．その結果，脱細胞化子宮内膜骨格 (Decellularized Endometrial Scaffolds, DES)を用いることで，より効率的に子宮内膜の全層再生が促されることが判明した．さらに光遺伝操作と再細胞化（再生）に適した細胞の候補として，様々な子宮内膜由来細胞（正常・不死化・癌細胞）とその幹細胞について検討を行ったところ，ある内膜癌幹細胞株が安定期に幹細胞特性を有することが明らかになり，その幹細胞特性や再生医療への応用について検討した．また子宮全体の再生および子宮疾患の代表である子宮筋腫の病因メカニズムの解明の観点から，ヒト子宮平滑筋細胞に光応答性ゲノム編集ではなく通常のゲノム編集による遺伝操作を加えて増生能力の増強や造腫瘍能の獲得の有無などを検討したところ，一部に変化は見られたが予想していた特性は付与されず，その原因として用いた細胞が平滑筋幹細胞では無かったことが考えられた．また，光応答生ゲノム編集技術の改善・改良と新しい研究ツールや治療法としての妥当性を検証するべく， 着床に関連する挙動を示すものの機能不明の新しい分子を光応答性ゲノム編集の標的分子として基礎的解析も行った．異所性に子宮内膜様病変を作成して子宮内モデルを構築する際に，内膜症候補細胞を搭載したDESや磁性体などを用いて細胞を集積するなどの技術が必要となるが，その技術開発も行った．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】脳神経外科学

【研究領域課題番号】16K15648 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脳腫瘍学 / ゲノム編集 / 幹細胞 / 自殺遺伝子

【研究成果の概要】

はじめに、ヒトiPS細胞から分化誘導した神経幹細胞(NSC)にウイルスベクターを用いてHSV-tK遺伝子を導入した。脳腫瘍モデルマウスにHSV-tk発現NSCを移植し、Ganciclovir (GCV) を投与したところ、著明な治療効果が認められた。つぎにゲノム編集によりHSV-tk遺伝子をiPSに導入したところ、細胞毒性により安定したiPS細胞株が樹立できなかった。そこで、遺伝子発現誘導システムを用いて、Tet-inducible HSV-tk導入iPS細胞を樹立した。治療用NSCを誘導し、脳腫瘍モデルマウスに移植後、GCVとDoxycyclineを投与すると、著明な治療効果が確認された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】16H05474 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 脱細胞化 / 再細胞化 / CRISPR/CAS9 / ゲノム編集 / 再生医療 / 生殖医療 / 光遺伝学 / 子宮再生 / iPS細胞 / 生殖医学 / 細胞治療 / ティッシュエンジニアリング / CRSPR/CAS9 / 幹細胞 / 遺伝子制御

【研究成果の概要】

齧歯類における脱細胞化子宮内膜組織（DES）を用いた内膜再生技術と光応答性CRISPR/CAS9（光CAS9）による遺伝子編集システムの開発を行った。内膜菲薄化・欠損モデルにおいて、DES移植により腺管構造を有する内膜の再構築が可能であった。その際、正しく再構築されるためには、用いるDESの構造極性が重要であった。一方、光CAS9の遺伝子編集を通じて、in vitroでの遺伝子の発現を抑制・増強できること、さらにin vivo子宮においてもその遺伝子編集により生殖能を任意に制御することが可能であった。両技術の融合による子宮内膜の再生を目指した新しい治療法・研究ツールの基盤知見・技術が得られた。

【研究の社会的意義】

DESと再細胞化技術による子宮内膜組織の再生は、アッシャーマン症候などの内膜菲薄化・欠損患者に対して有用な治療になり得る。一方、反復着床不全による不妊症や不育症の原因となる内膜の機能不全は、光CAS9という時空間的制御可能なゲノム編集システムを用いて遺伝的アプローチからその異常を是正することにより、改善・解決が可能である。本研究の成果は、新しい内膜機能・構造の再生・再建医療の開発につながる点で社会的意義が大きい。さらに、これらの技術を単独あるいは融合させることにより、子宮内膜の機能と構造を担う分子細胞生物学的メカニズムを明らかにする研究手法ツールになり得る点で、学術的意義も高い。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】医学物理学・放射線技術学

【研究領域課題番号】24601016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 神経幹細胞 / ゲノム編集 / p53 / 放射線 / レポーター遺伝子 / DNA傷害 / 蛍光蛋白質

【研究成果の概要】

細胞の染色体に存在する遺伝子に対して障害性を有する放射線（ガンマ線、X線など）について、その障害を評価し得るレポーター細胞の創出を本研究は目的とした。DNA組み換え技術により、p53遺伝子座を含むBAC DNA (RP11-89D11)上にオワンクラゲ由来蛍光蛋白質とホタル由来発光蛋白質の融合遺伝子（dVenusLuc2）を挿入置換したBACレポーター遺伝子の作成を完了した。また、近年発達してきたゲノム改変技術（CRISPR-CAS9法）により、H9 ES細胞由来神経幹細胞株の内在性p53遺伝子座にレポーター遺伝子dVenusLuc2が適切に挿入されている細胞を選別し、株化を達成した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)