Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

RNA interference / RNAi / siRNA / human / genome / 機能解析 / siRNAライブラリ / RNAi関連遺伝子 / humna / mouse

ヒトをはじめとする様々な哺乳類ゲノムプロジェクトの進行により哺乳類の遺伝情報を担うおおよその遺伝子が特定され、ゲノム研究は、その構造解析から機能解析に焦点が移ってきたと言える。本研究では、ヒトを含む哺乳類の網羅的ゲノム機能解明のためのRNAi関連技術を開発し、siRNAミニライブラリを構築して、RNAi関連遺伝子群のスクリーニングを行った。我々は、RNAi効果の高いsiRNA配列の選択法を確立しており、(1)ガイド鎖の5'末端がAまたはUであり、(2)パッセンジャー鎖の5'末端がGまたはCであり、(3)アンチセンス鎖の5'領域にAまたはUが多く、(4)長いGCの連続配列がないsiRNAはRNAi効果が高いことを報告している。DNAベクターからsiRNAを発現させる場合、既存のベクター(RNA polymerase IIIプロモータ型)では、ベクターの特性にあったsiRNA配列でなければならないため、選択できる配列が限られる。このような問題を解決するため、RNA polymerase IIプロモータを用いたベクター系を構築した。さらに、Dicerによる2本鎖RNAの切断パター一ンをin vitroで解析した結果、長い2本鎖RNAは、Dicerによって、最終的には21または22bpのsiRNAに切断されることがわかった。我々は、21bpのsiRNAに関しては、RNAi効果の高いsiRNAの配列規則性を提唱していたが、この結果を踏まえて、22bpのsiRNAにおける効く配列規則性の検討を行い、高い確率で有効である配列の規則性を報告した。さらに、2種のsiRNAを直列に繋いだ2本鎖RNAによって、ダブルノックダウンが可能であることを示した。ヒト、マウスの転写因子、アポトーシス関連遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、核酸結合遺伝子などのミニライブラリを作製して、マウスEmbryonic stem(ES)細胞、ヒトHeLa細胞でのスクリーニングを行い、これらに関連する遺伝子群の候補を同定した。

RNA干渉 / RNAi / siRNA / ヒト / マウス / 有効siRNA配列 / ウェブサイト / off-target / 遺伝子機能破壊 / 哺乳類 / 全ゲノム遺伝子 / RNA干渉法 / Dicer / eIF2C1 / インターフェロン / ヒトゲノム / 哺乳類培養細胞 / ds RNA / SiRNA / ルシフェラーゼ / アポトーシス

RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入し塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する方法で、ポストゲノム・シーケンス時代の網羅的遺伝子機能破壊法として注目されている。哺乳類においては、dsRNAによるapoptosisを避けるために21bpからなるsiRNAが長いdsRNAの変わりに用いられてきた。
我々は、はじめに、哺乳類におけるsiRNA依存的RNAiに、eIF2C1-4及びDicerが必要であり、これらのタンパク質がeIF2CのPIWIドメインを介して相互作用する事を明らかにした。次いでヒトやマウスの遺伝子機能解明をゲノムワイドで実施する上で問題となるsiRNA法の問題点、即ちランダムに設計したsiRNAのおよそ80%は役にたたないという問題にチャレンジし、それを実際的に克服する方法を見出した。内容の詳細は、発表論文に譲るが、有効なsiRNAは、4つの条件を同時にみたしており、これらは、少なくとも部分的にsiRNAのRISCへの取り込みとsiRNAの変性の過程に依拠していると推定された。コンピュータをも知多解析から、ヒトやマウスのほとんど全ての遺伝子に有効なsiRNAが設計できることが分かり、ここで開発した手法で求めたsiRNAの配列を用いて、ヒトマウスのほとんどの遺伝子の機能かは異がかのうであることが分かった。良く効くsiRNA配列は、細胞内で、配列の類似している別の遺伝子由来のmRNAを破壊するかもしれない。この効果をoff target効果という。off target効果を最小にするコンピュータプログラムをコンピュータ科学の専門家(東京大学大学院新領域研究科・森下真一教授)との共同研究でつくり、最適siRNAを、投入した任意の配列に対してコンピュータで素早く応答するweb site (siDirect)を構築した。

【研究分担者】
程久美子	東京大学	大学院理学系研究科	助教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
程久美子	東京大学	大学院・理学系研究科	科学技術振興特任助教授	(Kakenデータベース)