【研究領域課題番号】20H00417 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミトコンドリア / ゲノム編集 / 細胞質雄性不稔

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】45,240千円 (直接経費: 34,800千円、間接経費: 10,440千円)

【研究領域課題番号】20H02906 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Aspergillus niger / citric acid production / CRISPR/Cas9 / genome editing / transporters / Aspergillus tubingensis / citric acid / organic acid transport / mitochondria / Aspergillus　tubingensis

【研究成果の概要】

クエン酸高生産糸状菌Aspergillus tubingensis WU-2223Lを供試菌として効率的なゲノム編集技術を確立し（I. Yoshioka, and K. Kirimura, J. Biosci. Bioeng., 131 (6), 579-588 (2021)）、有機酸輸送体遺伝子の機能解析に応用した。ゲノム編集技術を用いて、ミトコンドリアに局在する有機酸輸送体タンパクをコードする遺伝子の機能解析を実施し、クエン酸生産に関与する輸送体遺伝子を特定することに成功した（論文投稿中のため詳細省略）。また、細胞質から細胞外（培養液）へクエン酸を排出するタンパクCEXAについて機能解析を進めた。供試菌はグルコースを炭素源とした場合に2%(v/v)メタノールの培地への添加によってクエン酸生産量が増大する、いわゆるメタノール効果を顕著に示す菌株である。メタノール効果は1940年代に見出されていたが、その本質は不明なままであった。申請者はメタノール効果の1つの標的がCEXAをコードする遺伝子cexAで、この遺伝子を高発現させればメタノール非存在下でもクエン酸生産量が高いクエン酸生産糸状菌が作製できるとの作業仮説を立て、これについて検証した。まず、CEXAをコードする遺伝子cexAのノックアウトによってクエン酸生産能を欠失した株を作製した。つぎに、これを宿主として、ゲノム編集技術によりtef 高発現プロモーターの下流にcexAを配置してcexA高発現株を作製し、クエン酸生産能力を検討した。当該高発現株は、メタノール非存在下でグルコースを炭素源として（親株である）WU-2223L株より高いクエン酸生産量を示した（論文投稿中、数値省略）。すなわち、予想通り「メタノール効果非依存型」のクエン酸生産糸状菌の作製に成功し、約80年前からの謎であったメタノール効果の本質を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】13,520千円 (直接経費: 10,400千円、間接経費: 3,120千円)

【研究領域課題番号】19KK0391 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミトコンドリア / ゲノム編集 / 植物ミトコンドリア / ミトコンドリアゲノム編集

【研究成果の概要】

2021年度もコロナ禍のために共同研究先への直接訪問は叶わなかった。しかしながら、昨年度に米国で開発された哺乳類ミトコンドリアゲノム編集技術一文字編集について、これを応用することで、葉緑体ゲノムの標的一文字塩基置換法を確立することができ、これを論文発表した。当該技術は韓国のグループと同着で論文掲載されたが、新聞やウェブサイトなど国内外で多数紹介してもらうことができた。この技術を新たに武器に加えて、当該国際共同研究では、植物側の（標的配列に二重鎖切断を起こすだけでなく、塩基の置換によるミスマッチを起こした時の）修復機構について解析が可能となり、こちらにもその研究対象を広げて現在も引き続き実験中である。植物ミトコンドリアゲノムについても標的一文字塩基編集が成功できており、こちらは執筆時に論文アクセプトがされており、2022年度中に論文公開される予定である。植物ミトコンドリアゲノム編集の第一世代、DNA二重鎖切断を引き起こす方法では、大規模な延期欠失とゲノム構造が変化してしまうという特徴があったが、新しい塩基置換方法は、そのような大きな変化を起こすことなく、ピンポイントに一文字だけの改変が可能であり、この点でも新しい技術と解析方法につながっている。植物ミトコンドリアゲノムについての標的切断技術、ミトコンドリアと葉緑体についての一文字編集技術は、比較的難しい技術であることもあり、さらに国内外から共同研究による実行を打診され、できる限り引き受けている。このため、当初予定を超えた共同研究数、植物の種類や対象遺伝子数が増え、また多角的な遺伝子撹乱による解析ができることから深みのある研究考察につながることで、質的にも良い方向に向かっており、2022年度も引き続き発展展開させていきたいと考えている。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(A))

【研究期間】2020 - 2022

【配分額】15,210千円 (直接経費: 11,700千円、間接経費: 3,510千円)

【研究領域課題番号】18K19202 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミトコンドリア / 細胞質雄性不稔 / 植物ミトコンドリア / ゲノム編集 / mitoTALEN

【研究成果の概要】

植物ミトコンドリアにあるゲノムはこれまで安定した改変が不可能であったが、申請者らはゲノム編集技術mitoTALEN法を用いた世界初の安定改変に成功している。この技術を用いて標的配列切断とゲノム構造改変を通じて多様なゲノム編集植物集団を作ることで、育種上重要な細胞質雄性不稔性質を付与する実験をおこなった。明確な細胞質雄性不稔個体は取れなかったが、モデル植物での効率の良い植物ミトコンドリアゲノム編集技術の確立が高い評価を受けており、国際論文掲載、学会技術賞受賞、国際共同研究の進展につながった。

【研究の社会的意義】

植物ミトコンドリアゲノムには、植物ゲノム全体のうち1%以下しか情報をコードしていないが、生育に必須の細胞呼吸や、農業上多用されているF1育種に必要な細胞質雄性不稔の原因遺伝子などがコードされており、その人為改変は待望されてきた。申請者らはこれを安定改変/ゲノム編集する方法を世界に先駆けて成功させており、現在学術的に注目を集めている。元々イネとナタネで成功させていた方法だが、植物モデルのシロイヌナズナで、高効率に成功させる技術を開発展開させたところから、今後さらに未解明事項の多い植物ミトコンドリアやエネルギー生産/農業生産向上に直結する細胞質雄性不稔性の理解と改変応用につながる研究を加速させる。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2018-06-29 - 2022-03-31

【配分額】6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)

【研究分野】遺伝育種科学

【研究領域課題番号】16K14827 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム編集 / ミトコンドリアゲノム / 植物ミトコンドリア / ミトコンドリアゲノム編集 / 植物ミトコンドリアゲノム / ミトコンドリア

【研究成果の概要】

植物ミトコンドリアゲノムは安定的な形質転換が不可能である。ゲノム編集技術TALENを用いて、最近、ミトコンドリアゲノムの任意箇所の切断、修復、ゲノム構造変化の誘起が報告された。本研究では、よりベクター作製が簡便でDNA切断効率の高いCRISPR/Cas9法をミトコンドリアゲノム編集に適用させることに挑戦した。ミトコンドリア内のDNAを標的切断するために、Cas9タンパク質にミトコンドリアマトリクス局在シグナル配列を付加した。残念ながらこの方法ではミトコンドリアゲノム上の標的DNAの切断/変異導入/DNA消失などは認められなかったが、植物ミトコンドリアゲノム編集法の改良法の展開につながった。

【研究の社会的意義】

細胞内には核のほかに，葉緑体とミトコンドリアの中にもゲノムが存在します．このうち植物ミトコンドリアのゲノムだけが改変が不可能でしたが，最近我々のグループによって世界で初めてゲノム編集技術TALENを応用した方法で成功しました．ミトコンドリアゲノムの改変は，基礎生物学的にも農業応用上も重要な対象です．今回の試みでは，植物ミトコンドリアゲノム編集技術を，TALENを用いた方法から，より作製方法が容易なCRISPR/Cas9法を応用して挑戦しました．この方法でのゲノム改変は残念ながら達成できませんでしたが，植物ミトコンドリアゲノム改変法の改良を進めるための手助けとなる知見が多数得られました．

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)