Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

グリーンマウス / グリーンラット / レッドマウス / 着床 / キメラ / MAPC細胞 / 異種胚キメラ / ジフテリアトキシン / Creリコンビナーゼ / トランスジェニックマウス / loxP / 骨髄細胞 / 幹細胞 / GFP / 異種移植 / ラット / マウス / 妊娠

異種胚生着の目標の一つは、臓器移植などに使用できるような臓器を異種の動物に作らせることである。そのために必要なことは、目的の臓器を欠損した動物と、その臓器以外が欠損するような動物を組み合わせることにある。異種キメラにおいて片方の胚に由来を限定する方法について検討を行った。
即ち、ジフテリアトキシンをLoxP配列で挟んでおき、Creリコンビナーゼが働いたときにだけ毒素遺伝子が転写されるようにしくんだトランスジーンを作製した。ついでこのトランスジーンをもつトランスジェニックマウスを作製し、現在ひとつのラインを樹立した。さらにこのラインのほかに臓器特異的に発現するCreリコンビナーゼとして、精子が産生されるときにのみ働くプロタミンのプロモーターを用い、その制御下にCreリコンビナーゼを発現するようにしたトランスジーンをもつ別のトランスジェニックマウスを作製した。このように作製したジフテリアトキシンをもつトランスジェニックマウスと、Creリコンビナーゼをもつマウスを交配して、得られる産子に初期の目的どおりのフェノタイプが現れるか否かを検討したところ、計画通りに精子を欠損する不妊のマウスが得られた。このことからわれわれの設計どおりに、一部の臓器のみを欠損させる動物をデザインどおりに作製できることが示された。
またキメラマウス作製の過程で雌雄キメラを作製し、一個体内における雌雄細胞の分布やその運命について検討を加え、雄に分化した個体の中では雌の細胞も精原細胞になることを見出すとともに一部雌細胞は精巣の中で卵子に分化できることを示し生殖細胞の性の分化に関する基本的な仕組みを明らかにするとともに、異種キメラによる生殖細胞の作出のための基礎データをえることができた。
これらの研究を通じて異種キメラ作製法を基本にした臓器移植の基礎データをかためることができた。

ES細胞 / 遺伝子ノックアウト / ジーントラップ / Cre / loxP / Creリコンビナーゼ / コンディショナルノックアウト / ノックアウト / GFP / トランスジェニックマウス

本研究は、Cre/loxPシステムを利用したジーントラップ法によりランダムに遺伝子を破壊したマウスを作製しライブラリー化すると同時に、第2世代のノックアウトに必要な臓器特異的、発生時期特異的なマウスのライブラリー化の道を開こうとするものである。
1)ES細胞でのジーントラップと破壊遺伝子の同定
PGKプロモーターの制御下に内在性遺伝子のpoly-A付加シグナルを利用してPuromycin耐性遺伝子を発現する、と同時に、内在遺伝子のプロモーターの制御下にCreリコンビナーゼを発現する新規トラップベクターを開発した。このトラップベクターを用いてES細胞でジーントラップを行い、約600個の薬剤耐性クローンを単離、解析した。しかし内在性遺伝子がトラップされたものは64クローンにとどまった。トラップした遺伝子を3′-RACEにより解析した結果、既知遺伝子が9つ、ESTで報告されている遺伝子が2つ、それ以外は新規遺伝子であった。ベクターを改良し、あらたに34個のトラップクローンを樹立した。このうち4つは既知の遺伝子であった。改良ベクターは遺伝子の発現時期や部位にかかわらず、ES細胞を使用してトラップすることが可能であることが示された。
2)ES細胞クローンからのキメラマウス作製と解析
トラップした遺伝子を同定できたES細胞クローンからキメラマウスを作製した。その結果、これまでに約10ラインの遺伝子欠損マウスを作製することに成功している。今後は、これら遺伝子欠損マウスの表現型を調べると同時に、遺伝性疾患との関連についても検討する。また、トラップした遺伝子のプロモーターの制御下に働くCreリコンビナーゼが正しく発現しているかどうか検討し、コンディショナルノックアウトマウス作製時におけるCre発現トランスジェニックマウスとしての有効性を検討するためのレポーターマウスを作製した。

【研究分担者】
蓮輪英毅	大阪大学	遺伝情報実験センター	助手	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
鈴木宏志	中外製薬株式会社	創薬資源研究所	主任研究員
伊川正人	大阪大学	遺伝情報実験施設	助手	(Kakenデータベース)
鈴木広志	中外製薬株式会社	創薬資源研究所	主任研究員