【研究領域課題番号】19K17977 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン分泌 / 膵β細胞 / ユビキチン / 糖尿病 / インスリン

【研究成果の概要】

ゲノムワイド関連解析で東アジア人特有の2型糖尿病関連遺伝子としてUBE2E2が報告されたが、その機序は不明である。膵β細胞における役割を検証するため、膵β細胞特異的UBE2E2トランスジェニックマウス(TGマウス)を作製した。独立した2ラインで糖負荷試験時のインスリン分泌低下を伴う高血糖を呈した。離乳期以前のβ細胞量と増殖能の低下、p21の発現高値を認めた。プロテオーム解析でMesothelin(MSLN)の著明な低下を認めたが、MSLN全身ノックアウトマウスは正常耐糖能であった。
膵β細胞のUBE2E2の過剰発現は個体としての膵β細胞量の低下を介して糖負荷後のインスリン分泌低下に関与していた。

【研究の社会的意義】

本研究に用いるモデルマウスは当研究室で独自に作製されたものであり、類似の研究結果は国内外を含め未だ報告されていない。また、以前より日本人と欧米人の糖尿病の病態は異なることが広く知られているが、本研究結果で明らかになった事象に基づき検討を行うことで、日本人に特徴的な糖尿病発症の素地やメカニズムの一端を解明できるかもしれない。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究領域課題番号】18H02861 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵臓β細胞 / ドパミン / VMAT2 / インスリン分泌 / 膵臓 / 内分泌細胞 / 血糖維持 / 分化 / 多能性幹細胞 / インスリン / 糖代謝 / 増殖 / 膵臓分化 / 内胚葉 / 糖尿病 / 分化誘導 / 恒常性維持 / 分泌

【研究成果の概要】

膵臓β細胞の恒常性維持の分子基盤の解明を目指し、膵臓β細胞特異的なVMAT2遺伝子変異マウスの解析を進めた。変異マウスでは、細胞内ドパミンが減少し、糖応答性インスリン分泌が上昇した。高脂肪食を給餌した条件では、β細胞の脱分化、β細胞死や耐糖能の悪化が認められた。詳細な解析の結果、糖応答性インスリン分泌とともにドパミンが分泌されるが、VMAT2の欠失β細胞では、再取り込みされたドパミンは分泌小胞に格納されずに、細胞内の分解酵素MAOにより分解され、ROSが発生する。高脂肪食条件では、インスリン分泌が亢進し、次第にβ細胞はROSにより脱分化、そしてβ細胞死が引き起こされることに至ることが分かった。

【研究の社会的意義】

VMAT2-ドパミンシグナルは膵臓β細胞の分化抑制シグナルとして働くのみならず、β細胞の量を制御するシグナルでもあり、糖応答性インスリン分泌を負に制御するシグナルである。一方、VMAT2-ドパミンシグナルを欠くと、糖応答性インスリン分泌が亢進した。高脂肪食給餌条件下では、β細胞特異的VMAT2遺伝子変異マウスは、対照の野生型よりも早く耐糖能の改悪を示し、β細胞の脱分化、脱落を引き起こした。これらの結果から、膵臓β細胞を正常に維持するためには、負に制御するシグナルが重要な役割を果たすことが示された。膵臓β細胞の恒常性維持のためには、その機能を適宜に制御することが重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】17K09455 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵臓 / インスリン / ドーパミン / GPCR / iPS細胞 / 分化 / 膵β細胞 / iPS / 脱分化 / 糖尿病 / 再生医療

【研究成果の概要】

ヒトiPS細胞から分化誘導したβ様細胞への分化効率の上昇と成熟度の向上にドーパミンの合成阻害剤やドーパミンを貯留するためのトランスポーター（VMAT2）の阻害剤の培地中への添加が効果的である。脱分化の進行を抑制することが主たる効果であった。
β様細胞の分化、成熟化の過程でみられる弱いインスリン分泌は細胞の成熟化を促進する遺伝子の発現上昇とともに、同時進行する脱分化を促進することを明らかにした。また、VMAT2を膵β細胞でのみ欠失するマウスの解析実験により生体内では生後も成熟化・脱分化をβ細胞毎に違うバランスにおくことで一部のβ細胞だけが膵臓内で機能することが示唆された。

【研究の社会的意義】

β細胞が主たる構成要素である膵島は内部のβ細胞が均一な分化・成熟化レベルではない。高い成熟度を維持し続けることは、β細胞の脱分化・細胞死につながることを本研究におけるマウス個体を用いた実験で実証した。今後、再生医療にヒトiPS細胞由来β様細胞を使用するうえで、より長期的かつ生体内に近い血糖値維持を達成するためには、生体内における膵島内の細胞間相互作用を理解、再現することが必要不可欠である。モノアミンを介した細胞間相互作用機構の一部を解明することができたことは、再生医療の実現化に貢献できたと考える。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】26253059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

多能性幹細胞 / 分化誘導 / 糖尿病 / 再生医療 / 膵臓 / 代謝 / 増殖 / モノアミン / ドパミン / インスリン / 化合物 / 再生医学 / 膵β細胞 / 膵臓β細胞

【研究成果の概要】

本研究ではヒトiPS細胞から十分な機能を持つ膵臓β細胞を作成するために、分化誘導の促進化合物の同定、作用機序の解明を目指した。また、代謝による分化促進の利用により成熟度の高い膵臓β細胞の作成を目指した。その結果、新規にWnt シグナルがβ細胞の分化に対して促進効果があること、マウスES細胞の系で見られたVMAT2-モノアミンによる分化抑制効果はヒトiPS細胞の分化誘導系にも存在することを見出した。また、成体膵島におけるドパミンD2受容体を介した膵臓内分泌β細胞の量を負に制御する機序が存在し、この機序は、Gタンパク共役受容体であるアデノシン受容体A2Aの抑制にもカップルしていることが分かった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】41,340千円 (直接経費: 31,800千円、間接経費: 9,540千円)

【研究分野】内分泌学

【研究領域課題番号】24790949 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES・iPS細胞 / 膵β細胞 / インスリン / 糖尿病 / 低分子化合物 / モノアミン / 膵臓 / β細胞 / VMAT2 / ｃAMP / ES・iPS / 膵 / ES / iPS

【研究成果の概要】

本研究では、1200の低分子化合物の中からVMAT2阻害剤にマウスES細胞から膵β細胞を分化誘導する効果が高める効果があることを見つけました。VMAT2は細胞内小胞に存在するモノアミン量を調節する因子です。そして、膵β細胞が糖濃度に応じてインスリンを分泌する能力を促進する化合物も見つけました。これらの2種類の化合物を併用して分化湯堂を行い、糖尿病モデルマウスへ移植したところ正常な血糖値に回復しました。今後、この研究で得られた情報をもとにヒトiPS細胞からの膵β細胞の分化誘導を進め、将来的な臨床応用に貢献できるよう研究を進めます。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】20591051 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵β細胞 / IRS / CREB / CaMK / 糖尿病 / 代償性肥大 / lRS-2 / カルモジュリン依存性キナーゼ

【研究成果の概要】

(1)膵β細胞のIRS-2量調節では、グルコース刺激が重要である。(2)グルコース刺激がCaMK-4、CREBを介してIRS-2を調節している。(3)db/dbマウスなどの膵β細胞代償不全モデルでは、グルコース・センシングに重要なグルコキナーゼ、Glut2の発現低下が見られ、糖流入が減ることにより、IRS-2が低下し、膵β細胞の保護システムが破綻すると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】18390095 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵β細胞 / Wntシグナル / 糖尿病 / 肥満 / β-cell adaptation

【研究成果の概要】

膵臓のラ氏島は肥満・インスリン抵抗性などインスリンの需要が高まるときに増殖するが、その機序については不明な点が多い。私たちはこれまでWntシグナルの重要性をLRP5というWntシグナルの受容体のノックアウトマウスの解析から、高脂肪食を5ヶ月負荷したマウスではインスリンの分泌が減弱することから示唆し(PNAS2003)、さらに、膵ラ氏島のトランスクリプトームの解析から、SOX6と言う転写因子が膵β細胞特異的な転写因子PDX1を抑制することを示してきた(JBC2005)。我々はこれらのデータをもとにSOX6が膵β細胞増殖への関与について解析を行った。その結果、SOX6のsiRNAによるknock downによってinsulinoma MIN6とINS1細胞は増殖が亢進し、逆にレトロウィルスの過剰発現によって増殖は抑制された。HIH3T3細胞を用いた詳細な細胞周期の解析ではサイクリンD1、D2、E1のG1/S期を促進に関与するサイクリンの減少、そしてp27KipのG1/S期のブレーキに関与する分子の発現の亢進が認められた。この機序として、転写因子sOX6は、βカテニンと直接結合し、Wnt/βカテニンシグナルを抑制すること、そしてその抑制機序としてhistone deacetylase complexと直接結合し、サイクリンD1プロモーターのヒストンアセチル化を阻害する機序を示した。さらにSOX6はサイクリンD1プロモーター上でHDAC、βカテニン、TCF4と複合体を形成しDNAに結合することをChIPアッセイによって示した。SOX6がどのようにして、肥満・インスリン抵抗性時にその発現が減少するかについては未だに明らかではないが、このような病態でSOX6が膵ラ氏島で減少することによって、膵細胞の増殖を促すことを示すとともに、PDX1という膵β細胞にとって必須な転写因子の抑制も解除することから、膵β細胞の機能、さらには、膵β細胞の代償機構に関与していることが示された(JBC2007)。我々はさらに、Wnt/βカテニンシグナルの直接標的因子としてCoup-TF IIという核内受容体をみいだした。Coup-TF IIが転写抑制複合体(HDAC,NCoR,SMRTe)を標的遺伝子としてリクルートするメカニズムを解明した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】16,830千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 2,130千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】18590978 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

糖尿病 / シグナル伝達 / 膵ベータ細胞

【研究成果の概要】

1.IRS-2発現・タンパク量調節の分子機序解明:マウス膵島や単離膵島を用いた実験より以下の事実を見出した。A.膵島IRS-2発現は主としてグルコース刺激によって正に制御されている。B.このグルコースによるIRS-2発現増加はグルコース代謝とカルシウム流入を必要とする。C.グルコースによるIRS-2発現増加は転写因子CREBの活性化を必要とする。D.グルコースによるCREBの活性化、IRS-2の上昇はPKAでなく、カルモジュリン依存キナーゼの役割が大きいことを見出した。
2.膵島代償増殖におけるグルコース・IRS-2経路の重要性:肥満糖尿病マウス(ob/ob、db/db、KK-Ay,KK/Taマウス)の膵島において、膵島が代償性増殖を起こしている時にはCREBが活性化しておりかつIRS-2量が増殖しており、この経路が膵島の代償性増殖に果たしている役割が確認された。
3.IRS-2の膵島代償性増殖における役割:既報(J Clin Invest. 2004;114:917-27. Diabetes. 2000;49:1880-9.)に加え、代償性膵島増殖障害を来たす膵臓特異的グルコキナーゼ欠損マウスの膵島にIRS-2を過剰発現させることにより、代償性増殖をある程度回復させえることを示した。
4.DNAマイクロアレイによる探索:代償性増殖を起こしている膵島の網羅的遺伝子解析を行い、発現量が有意に変化している遺伝子群を300以上同定した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,890千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】17390261 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵β細胞 / インスリン分泌 / インスリン受容体基質 / IRS-2 / β細胞の増殖 / 高脂肪食 / 糖尿病 / 増殖

【研究成果の概要】

2型糖尿病の発症には、インスリン抵抗性とインスリン分泌低下の両者が関与する。私どもはインスリン受容体基質(IRS)-2の欠損マウスを作製し、肥満及び肝臓でのインスリン抵抗性に対し膵β細胞が十分に増殖できないため、相対的なインスリン分泌不足をきたすことにより糖尿病を発症することを明らかにした(Diabetes 49:1880-9,2000、J Biol Chem.279:25039-49,2004、J Biol Chem.280:3331-7,2005)。IRS-2欠損マウスに高脂肪食を負荷すると、野生型に比べ著しい高血糖を示した。野生型では膵β細胞が増殖するが、IRS.2欠損マウスでは膵β細胞の増殖が見られなかった(J.Biol.Chem.278:43691-43698,2003、J Biol Chem.278:14284-14290,2003)。IRS-2の膵β細胞の増殖における役割を明らかにするため、IRS-2-loxマウスを作製し、膵β細胞にCreリコンビナーゼを発現するマウスとかけあわせ、膵β細胞でのIRS-2を欠損したところ、インスリン抵抗性のない状態でも膵β細胞の面積は野生型に比べて低下していることを証明した(J.Clin.Invest.114:917-927,2004)。高脂肪食を負荷しインスリン抵抗性を誘導すると膵β細胞が増殖するが、この時、IRS.2蛋白質が著明に誘導される。一方、膵β細胞内でのブドウ糖代謝が低下したグルコキナーゼ(GK)欠損マウスでは、膵β細胞の増殖もIRS.2蛋白の発現上昇も認められなかった。IRS.2蛋白の上昇とCREBのリン酸化の亢進がパラレルであることから、膵β細胞内でのブドウ糖のGKによる代謝はCREBのリン酸化を介してIRS-2の発現上昇を誘導するものと結論した(J.Clin.Invest.117:246-257,2007)。
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【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】15,400千円 (直接経費: 15,400千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】15659217 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

IRS-2 / 糖尿病 / 膵β細胞 / Pdx1 / GLUT2 / 遺伝的背景 / positional cloning

【研究成果の概要】

129/Sv,C57Bl/6が混在した遺伝的背景のIRS-2,IRS-3ダブルヘテロ欠損マウス同士の交配により得られたオスマウスの解析では、6週齢では9群マウスの体重、血糖値に差を認めなかったが、14週齢時点ではIRS-2欠損マウスはIRS-3遺伝子型に関わらず有意な空腹時血糖上昇を認め、そのうち20-30%の個体が空腹時血糖300mg/dl以上の重症糖尿病を発症した。重症糖尿病個体の膵組織では膵β細胞中のインスリン顆粒がほとんど認められず、インスリン含有膵β細胞はほぼゼロにまで激減していた。また、膵β細胞の機能維持に重要と考えられるPdx1やGLUT2の発現も著しく低下していた。もともとのCBAとC57Bl/6の遺伝的背景では重症糖尿病を発症するIRS-2欠損マウスは0%で、C57Bl/6に戻し交配を進めても重症糖尿病を発症するIRS-2欠損マウスは認められなかったが、129/Svの遺伝的背景が高まるにつれ重症糖尿病を発症するIRS-2欠損マウスの割合が増加した。以上より、129/Svの遺伝的背景にはIRS-2欠損状態で糖尿病を著明に悪化させるmodifier gene(s)が存在すると考えられた。そこで129/Svの遺伝的背景でIRS-2欠損状態において糖尿病を著明に悪化させるmodifier gene(s)のマッピングと.Positional cloningによる同定を開始した。まず129/SvマウスとC57Bl/6マウス間で多型を有するDNA markerを全染色体で100個以上同定した。C57Bl/6Jに8回戻し交配をしたC57Bl/6J系統のオスIRS-2ヘテロ欠損マウスと129/Sv系統野生型メスマウス交配し、現在、50匹以上のIRS-2ヘテロ欠損オス、メスマウス(F1マウス)を得ていて、F1マウス同士の交配を進めている。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2003

【配分額】1,700千円 (直接経費: 1,700千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】14780647 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

糖尿病 / 細胞シミュレーション / システム生物学 / インスリン / 尿素回路 / E-Cell / E-CELL / 肝臓 / バイオインフォマティクス / 膵β細胞

【研究成果の概要】

本年度は、糖尿病の病態形成において主要な役割を果たす肝臓のモデル化を行った。その際、肝細胞(単一細胞)のモデルを敷衍して、肝小葉、肝臓といった高次の構造をモデル化することを試みた。近年の生物学の知見の多くは分子・細胞レベルのものなので、これを利用しつつ、組織、器官レベルを理解する方法の開発が今後重要となる。肝臓は肝小葉の繰り返し構造であり、肝小葉は、門脈枝から中心静脈にかけての類洞(毛細血管)とそれに接する肝細胞索を基本単位としている。そこで、この基本単位を、単一肝細胞モデルを直列に並べ類洞モデルによって接続する単純なモデルで表現し、既存の知見と比較した。代謝経路としで知見が多くかつコンパクトな尿素回路をモデル対象とした。尿素回路に関連する酵素、代謝物質は肝小葉内で不均一に分布していることが知られているが、8コンパートメントの直列肝細胞モデルを主体とした我々のモデルは、既知の不均一性をよく再現した。このモデルには、既知の尿素回路関連酵素について知られている3種類の遺伝子発現勾配が含まれているが、この結果は、これらの遺伝子発現勾配で尿素回路の肝小葉内不均一性が説明可能であることを示唆している。
また、糖代謝全体を俯瞰するための単純な糖代謝モデルも構築した。インスリン分泌、インスリン動態、インスリンによる調節を含む糖代謝の各モデルを連結した10元程度の微分方程式モデルで、経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)の時系列のシミュレーションを試みた。その結果、健常者の検査結果を再現するパラメータセットを得ることができた。今後は、このモデルを用い(必要に応じて改善、拡張し)、種種の病型の糖尿病患者のOGTT結果の再現を試みていく予定である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)