Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

枯草菌 / BAC / BGM / ゲノムベクター / RecA / トランスジェニックマウス

巨大DNA断片の遺伝子操作技術はゲノム機能解析に不可欠な基盤技術であり、ゲノム解読が進むにつれてますますその重要性が増している。Mbスケールの遺伝子操作が可能な枯草菌（BGM）ゲノムベクターに着目し、次世代のDNA改変システムの確立のため下記２つの研究を実施し、多様な遺伝子操作法やトランスジェニックマウスへの応用技術の整備、改良型BGMベクターの構築、学術研究への応用を達成した。本技術は、物質生産や人工ゲノム合成、トランスジェネシス、ゲノム機能解析など、遺伝子操作をおこなう産業・工学・学術のあらゆる分野への応用が期待できる。
１．キシロース誘導カセットを用いてRecA誘導型枯草菌株（inducible recA expression BGM vector: iREX）を構築した。iREXにおけるRecAの発現はキシロースにより厳密に制御されており、誘導時にはこれまで通りプラスミドやBAC-DNAをクローニングできることを示した。キシロース非存在下では、既存のBGMベクターで見られていた培養中の相同組換えを抑えることでより安定にインサートを保持でき、従来のシステムでは構築が難しかった複数の類似配列（レポーター遺伝子等）を含むような複雑なトランスジーンにも応用できることを示した。
２．BGMベクターの実用性を示すために、BACクローンの逆位・連結操作を駆使してマウス水棲型嗅覚受容体遺伝子ゲノム領域の再構築をおこない、Mbスケールの連結型トランスジーンの構築を試みた。252 kbまでは再構築できていたものの、サイズの大きなBAC-DNAのクローニングにおいて新たな課題が明らかになった。しかしながら別の発展課題において、BGMベクターでの遺伝子操作やトランスジェニックマウスの解析を駆使することにより、初めて水棲型嗅覚受容体遺伝子の発現制御領域の同定に成功した。

枯草菌 / ゲノムベクター / BGM / BAC / cIカセット / cIリプレッサー遺伝子 / ターゲットクローニング / バックグラウンド

真核生物のゲノムを用いたBGMベクターへの直接的なターゲットクローニングを行うに当たってゲノムサイズが比較的小さいシイタケゲノム(約40Mb)を対象とし、ゲノム中に数百コピー存在するLTR(Long Terminal Repeat)領域、約400bpを組み込むための足場として利用した。マーカーであるcIカセット(cI-spc)を挟むようにして2つのLTRを同方向に組み込んだBGMベクターを構築し形質転換を試みた。この結果幾つかのコロニーは得られたものの残念ながら目的とするシイタケゲノムを組み込んだ株は今のところ得られていない。原因としてLTR領域同士で組み換えが起こり欠してしまった可能性と、用いたゲノム自体に多くのダメージが入っていた可能性が考えられる。この点を改良すべく、ゲノムの精製法を改良する必要があり、また組み換えが起っても欠失しない(逆位となるように)2つのLTRを逆向きに組み込んだBGMベクターを作製する必要がある。これらに関して現在も引き続き調整中であり、また他の足場として交配決定遺伝子座(MATA座、約10kb)の領域についでも随意調整中であるが、残念ながら平成19年度中に良好な結果は得られなかった。しかしながら2年間の本研究を通じて2つのcIカセット(cI-spcとcI-BSを用いた形質転換で198kbと220kbのマウスゲノムを含む2つBACクローンを一度に組み込むことができ、さらにこれらを連結させ、355kbに及ぶJmjゲノム領域を再構築できた事は効果的なクローニング技術開発の一環として-定の成果であると考えられ、現在学術論文として投稿準備中であるとともにBGMベクターの多様なクローニング技術の開発について今後とも進展が期待される。