Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

微生物代謝 / 窒素代謝 / 脱窒 / Fusarium oxysporum / 亜硝酸還元酵素 / nirK / 共脱窒 / N2O / 放線菌の硝酸呼吸 / 硝酸還元酵素 / フラボヘモグロビン / P450nor

真菌(カビ)と細菌(放線菌と脱窒細菌)の新規な窒素代謝系の研究を行った。カビ脱窒系では亜硝酸還元酵素NirKの遺伝子取得に成功し、その研究を通じてミトコンドリアの起源と進化に関して新たな視点をもたらした。さらに、カビの共脱窒、S.coelicolorの新規窒素代謝、N2_O発生抑止型脱窒菌であるP.stutzeriTR2株の脱窒特性および生残性に関して、詳細な解析を行った。

脱窒 / Pseudomonas aeruginosu / nitrite reductase / 緑膿菌 / 脱窒遺伝子 / ヘムd1

細菌の脱窒遺伝子群の機能的発現を目的として研究を行い、当該研究期間において以下の点を明らかにした。
1.脱窒遺伝子群の解明従来までに亜硝酸還元酵素の遺伝子nirSを含むnirSMCF遺伝子配列が明らかにされていた。今回、さらに下流の遺伝子配列を明らかにしたところ、NirSMCFDLGHJENなるオペロン構造を有していることが明らかとなった。このうち、nirE遺伝子はS-adenosyl-L-methionine:uroporphyrinogenIIImethyltransferase遺伝子と相同性を有していた。遺伝子挿入実験等により、nirFDLGHJE遺伝子はヘムd1 生合成に必要であることが示された。
2.ANR及びDNRの機能新規調節遺伝子DNRを発見し、その脱窒反応等に及ぼす影響を以下の様に示した。
(1)ANR→DNR→脱窒というカスケード系が存在する
(2)DNRはアルギニンデイミナーゼ活性並びにシアニド生成を制御しない
(3)DNRがNIrS遺伝子上流プロモーター領域への結合性を有しているか否かの検討をフットプリンティングの手法を用いて行ったが、明確な答えを得ることができなかった。

亜硝酸還元酵素 / 蛋白工学 / 部位特異的変異 / 脱窒 / 電子伝達 / 銅蛋白

活性汚泥から単離した脱窒菌Alcaligenes faecalis S-6株において、同菌の脱窒の一過程を担う亜硝酸還元系は、亜硝酸還元酵素(NIR)およびシュードアズリンという二つの銅蛋白によって構成されている。同様な銅蛋白による亜硝酸還元系は後になって微生物からカビにわたって広く分布することが明かとなってきた。しかしながら今までに蛋白の銅配位環境と蛋白としての機能の関係、さらには二つの銅蛋白の銅原子間でどのように受け渡しされるのかについては全く明らかになっていなかった。本研究では蛋白工学的に蛋白を改変しそれらの性質を調べることで銅蛋白の構造と機能および銅蛋白間の電子伝達機構を明らかにすることとした。まず、そのための前段階として大腸菌でのNIR遺伝子の発現の最適化を行った。その結果、改変した分泌シグナルをNIR遺伝子に連結し、lacプロモーターの制御下、25-30・Cの低温で培養することにより、1リッター当たり3mg程度のNIRを大腸菌ペリプラズムに分泌する系を確立することに成功した。この系を用いて、NIRがサブユニット当たり1原子ずつ保持しているタイプI銅、タイプII銅の銅原子配位座(リガンド)のうち、タイプI銅リガンドのMet150をGluに、タイプII銅リガンドのHis135をLysに改変した酵素を作製、精製した。Met150Glu改変体は予想どおりタイプI銅を欠失していたが、His135Lys改変体はタイプIIリガンドのうちの1つが変化しているにも関わらず、タイプI、タイプIIの両方の銅を結合していることが明らかになった。次に、これらの改変体の活性を低分子のメチルビオロジェンを電子供与体として用いて測定したところ、His135Lysでは全く活性が検出されない一方、Met150Glu改変体では、十分な亜硝酸還元活性が検出された。これらの結果から、NIRにおいてはタイプII銅が活性に直接的に関わることがはじめて直接的に明らかになった。また、シュードアズリンの銅の周辺に位置するLys残基を中性または酸性残基に変換したところ、Lys10およびLys38の改変により、NIRへの電子伝達能が大きく低下することが明らかになりつつあり、シュードアズリンの銅原子周辺が、NIRと直接的に相互作用していることが示唆された。現在、NIRに含まれるタイプI銅の役割および、シュードアズリンのLys改変体を用いた、NIRとシュードアズリンの相互作用様式の解析を進めている。

【研究分担者】
佐々木康幸	東京農業大学	応用生物科学部	助教	(Kakenデータベース)
伏信進矢	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	教授	(Kakenデータベース)
若木高善	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	研究員	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
石井正治	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)