【研究領域課題番号】20K21471 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自閉症 / バルプロ酸 / セクレトーム / シナプス / プロテオミクス / 神経細胞 / 接着分子

【研究成果の概要】

自閉症（ASD; Autism Spectrum Disorder）とは発達障害の一つである。本研究においては、げっ歯類ASDモデルとして頻用されているバルプロ酸投与妊娠マウスの出生仔におけるASD様の行動異常を惹起するメカニズムを解析した。その結果、神経細胞シナプス接着分子の一つであるLingo2の代謝産物分泌型Lingo2（sLingo2）が興奮性シナプス過剰形成を起こしていることを明らかとした。今後、sLingo2が興奮性シナプス形成誘導をもたらす詳細なメカニズムを明らかにすることで、新たなASD発症機構の理解につながることが期待される。

【研究の社会的意義】

本研究でASDモデルマウスの病態と関連して見出されたsLingo2はヒトiPSC細胞由来神経細胞でもシナプス異常を惹起する。また、興味深いことに、Lingo2遺伝子を含む領域のコピー数変異がASD患者において見出されており、ASD患者の死後脳患者単一核RNAシークエンスデータを用いたモジュール解析においてもASDターゲット遺伝子としてLingo2が同定されている。すなわち、Lingo2はASDの発症に深く関わっていることが想定され、今後Lingo2を利用した新たなASD治療・予防薬や診断法の開発につながることが期待される。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2020-07-30 - 2022-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】24659028 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経細胞 / シナプス / 接着分子

【研究成果の概要】

脳における神経細胞間接続であるシナプスは、神経活動に応じた高い可塑性を持つことが知られている。その可塑性の分子基盤としてシナプス接着分子が知られているが、その代謝については不明であった。本研究において、自閉症に関連が知られているシナプス接着分子Neuroligin1が神経活動に応じて連続した2つのプロテアーゼによって切断を受け、シナプス形成を負に制御していることが明らかとなった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】神経・筋肉生理学

【研究領域課題番号】23500469 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シナプス形成 / シナプス可塑性 / 神経栄養因子 / シナプス / 海馬 / 神経科学 / 脳・神経 / 神経細胞 / 可塑性

【研究成果の概要】

分泌型シナプス形成因子であるCbln1は、２つの受容体GluD2とNeurexinの機能をリンクさせ、シナプスの形成と分化を制御する。海馬CA1神経細胞においては最も遠位部のTA層に、GluD2に類縁するGluD1受容体が限局して局在しており、TAシナプスで観察されるLTDの成立に関与することが明らかとなった。またノックアウトマウスの解析から GluD1の区画化には、Cbln1、Cbln4が必須であることを見出した。このことはneurexin－Cbln－GluDタンパク質複合体が小脳以外でのシナプス形成および神経回路構築においても機能することを強く示唆するものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】23300121 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分子動態 / タンパク質 / 神経細胞 / シナプス / 活動電位 / 膜電位計測 / 樹状突起 / スパイン / ２光子励起顕微鏡 / 蛍光相関分光法 / 拡散 / 2光子励起顕微鏡 / 分子・細胞神経科学 / タンパク質の動態

【研究成果の概要】

新規に開発した2光子励起顕微鏡システムを用い多点で同時に蛍光相関分光法(FCS)を適用することにより、1) 神経細胞樹状突起の細胞質中を高速に移動するタンパク質分子の動態を捉えること、および2) 神経細胞の膜電位計測を同時多点で行うことを目的とした。GFP発現プラスミドあるいはGFP融合CamKIIタンパク質発現プラスミドをマウス由来初代培養神経細胞に発現させ細胞質の複数点から蛍光強度変化の記録を10kHz以上の時間解像度で取得しFCS解析することに成功した。また、複数培養神経細胞から同時に活動電位記録を取ることに成功し、神経細胞のシナプス結合の有無および結合の方向性について解析を行った。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2011-04-01 - 2014-03-31

【配分額】20,020千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 4,620千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】12480236 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ドレブリン / 樹状突起スパイン / アクチン / シナプス可塑性 / シグナル伝達 / 神経培養 / 細胞骨格 / SH3P7 / シナプス / アクチン結合蛋白 / 培養 / 神経細胞

【研究成果の概要】

本研究はドレブリンファミリー蛋白(ドレブリンE、ドレブリンA、SH3P7)を介したシグナル伝達機構を担う蛋白群を、ドレブリンに結合する蛋白あるいはドレブリンを修飾する蛋白として網羅的に同定し、次に、これらの蛋白群ネットワークによるアクチン細胞骨格再構築制御のメカニズムで解析し、スパイン内シグナル伝達の分子基盤を解明することを目的とする研究である。まず、イーストツーハイブリッドシステムを用いて、ドレブリンファミリー蛋白(ドレブリンE、ドレブリンA、SH3P7)と結合する蛋白のcDNAクローニングを行い、ドレブリン結合蛋白DRAP1を同定し、そのアミノ酸配列を明らかにした。また、生化学的解析により、DRAP1のN末端領域がドレブリンのN末端領域と結合することがわかった。また、GFP融合DRAP1を発現するベクターを作製し、これを用いて線維芽細胞を形質転換させて強制発現させるとDRAP1は細胞内小器官特異的に集積することがわかった。
一方、初代大脳皮質神経細胞培養系に、アンチセンスオリゴヌクレオチド法を適用し、ドレブリンAの発現を抑制したところ、シナプス後部機能蛋白の神経活動依存的集積に変化が生じることを発見した。また、シナプス前部の機能蛋白の集積も減弱する事を見いだした。この発見は、ドレブリンを介したシグナル伝達が、シナプス前部ばかりでなくシナプス機能全体を調節している可能性を示した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】12780580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生 / 海馬 / 神経細胞 / 苔状繊維 / 脳障害 / シナプス / グルタミン酸 / 苔状線維

【研究成果の概要】

従来、中枢神経系の神経細胞には再生機能がないと考えられていたが、近年の研究により、軸索の切断や神経細胞の欠落などの障害時には、神経回路の再編成が行われることが明らかとなった。私は、海馬の神経回路網を保持したまま組織培養するという高度な手法を用いて、苔状線維を人為的に切断したところ、切断された線維は約一週間後には形態、機能ともにほぼ完全に回復することを明らかにした。この現象に対し種々の薬理学的検討を行い、苔状繊維の再編成には、cAMP/PKA ・ cGMP/PKG系(J.Neurosci., 21 : 6181-6194, 2001.)、代謝型グルタミン酸受容体(J. Physiol. (Lond.), 539:157-162, 2002)のシグナルが関与していることを示唆した。上記のように私は予定された通りの研究を平成13年度に遂行し、予想されていた以上の多くの知見を得ることに成功した。とくに、代謝型グルタミン酸受容体の関与は注目すべき発見である。従来、グルタミン酸は主要な神経伝達物質として認識されていたが、本研究では、神経回路の形成の調節因子として、新規な役割を見出すことに成功した。これは、同アミノ酸の役割に対する既成概念を覆す重要な知見である。また、苔状繊維の再生過程は、NMDA受容体→AMPA受容体の順に行われ、特にNMDA受容体伝達の再構築は3日程度で十分であることを見出した。本成果は現在投稿中である。この知見は、サイレントシナプスから機能的シナプスへの転換が神経機能再生への律速段階であることを示唆しており、再生医療における新たな医薬ターゲットを提唱している。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】10044237 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ドレブリン / シナプス / 老化 / アルツハイマー / 神経細胞 / 樹状突起 / development / aging

【研究成果の概要】

1. アルツハイマー病の脳の生化学的、組織化学的解析を系統的に行った。共同研究者のハタンパ博士はドレブリンが他のシナプス機能蛋白に比し、特異的低下を示すことを発見した。また、同時に正常の老化に従うドレブリン発現量の低下をヒト脳を用いて示した。また、ラット脳を用いてドレブリン含有シナブスの発生過程における変化を免疫組織化学的に解析した。生後0日から20日までのウイスターラットをホルマリン固定後、脳組織切片を作製し・ABC染色法および免疫蛍光染色を行った。生後10日齢以前ではドレブリンの分布には大きな変化はなく、細胞体,軸索,樹状突起でドレブリンが観察された。ところが14日齢ではドレブリンの局在は、既に樹状突起スバインに変化し、細胞体ではドレブリンは観察されなくなっていた。
2. 上記のドレブリン分布の変化が初代培養神経細胞においても観察されるかどうかを調べた。培養開始7日後:ドレブリンは突起に多く存在し、ドレブリン抗体により突起が連続性に染色された。また、細胞体ではドレブリンは細胞膜直下に集積していた。この時期には樹状突起スパインが形成され始めるといわれているが、ドレブリンの斑点状の集積はまだ観察されなかった。培養開始14日後:ドレブリンの染色像はほとんど斑状のものばかりとなるが、まだ細い突起は連続的に染まっている。培養開始21日後:ドレブリンの染色像は斑状のものばかりとなり、シナプトフィシン抗体との二重染色の結果から、ドレブリンの集積している場所は樹状突起スパインであることがわかった。以上より、ドレブリンの樹状突起スパインへの局在化はシナブスの機能成熟に一致して起こることが明らかとなり、神経活動依存的に局在化が起こる可能性が考えられた。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1998

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】09480219 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

樹状突起棘 / 細胞骨格 / ドレブリン / アクチン / 発達 / 老化 / シナプス成熟 / 神経発達 / 神経培養 / 神経細胞 / 樹状突起 / スパイン / シナプス / グルタミン酸受容体 / 海馬 / アクチンフィラメント / 遺伝子導入

【研究成果の概要】

(A)スパイン細胞骨格蛋白群の解析
ドレブリン特異抗体を固定化したビーズを用いて樹状突起スパインの細胞骨格蛋白群を調整すると、ドレブリンの他、アクチン、3種のミオシンとゲルゾリンがその中に含まれるていたが、さらに多くの未同定蛋白が含まれていることが蛋白電気泳動法により確認された。そこでこの標本を免疫源としてモノクローナル抗体を作製したところ、脳に特異的なミオシン用蛋白を認識する抗体(文献13)、神経細胞が分泌する細胞外基質を特異的に認識する抗体、カルモデュリンカイネースを認識する抗体がとれた(口頭発表11、13)。
(B)発達・老化に伴うスパイン細胞骨格系の変化
発達過程のラット大脳におけるドレブリンのアイソフォーム変換と樹状突起スパインヘの局在化を、経時的に調べた。(1)発達初期ではドレブリンは細胞体膜直下及び突起に連続性に分布しているが、発生が進むに従い、ドレブリンはクラスタリングすることがわかった。(2)次に、発達過程のラット大脳におけるドレブリンのアイソフォーム変換についてウェスタンブロッティングにより調べた。その結果、ドレブリンAの発現増加はドレブリンのクラスタリング時期と一致する事がわかった。(3)ドレブリンのクラスタリングはNMDA受容体活性に依存性であることがわかった(口頭発表4,7)。(4)また、このドレブリンAの発現増加に並行して、アクチン非結合型のドレブリンが激減することが観察された(口頭発表22)。従って、ドレブリンの樹状突起スパインヘの局在化は、RNAプロセッシングの変化により、ドレブリンのアイソフォームが成熟型となり、アクチンに対する結合活性が変化することにより引き起こされると推定された。(5)GFP融合ドレブリンを初代培養神経細胞に発現させたところ、スパインの長さが長くなることを発見した(文献9)。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】13,100千円 (直接経費: 13,100千円)