【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09044349 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JAK / STAT / サイトカイン / SH2ドメイン / チロシンキナーゼ / トランスジェニックマウス / ノックアウトマウス / ユビキチン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

サイトカインは受容体の細胞内ドメインに会合するJAKチロシンキナーゼを介して細胞内にシグナルを伝える。STATはそのシグナルを核へ伝える重要な転写因子のひとつである。
一方サイトカインシグナルを負に調節するメカニズムやサイトカイン間のクロストークの分子レベルでの解明も進んできている。われわれはSTAT5の負のフィードバック調節因子であるCIS1,JAKキナーゼの阻害因子であるJABをクローニング、さらにこれらを含むCISファミリーの存在を明らかにした。本研究では培養細胞を用いて、CISは受容体に結合することでSTAT5を抑制し、JABおよびCIS3は直接JAKのチロシンキナーゼドメインに会合しその活性を抑制することを明らかにした。CIS3,JABのノックアウトは完成しており現在解析中である。次にJABおよびCIS3のJAKシグナル抑制の分子機構を明らかにするために欠失変異や両者で保存されているアミノ酸に様々な点変異を導入し構造活性相関を行った。その結果JAB,CIS3のSH2ドメインはJAK2のactivation loopに存在するY1007にSH2ドメインを介して結合することを発見した。しかしJAK活性化抑制にはSH2ドメインだけでは不十分で近接したアミノ酸約12個の部分が必須であり、この部分はJAB,CIS3でよく保存されている。この領域をキナーゼ阻害領域と名付けた。またこのN末端部分がないとJAKへの結合力が極端に落ちることからJAB,CIS3はSH2ドメインでactivation loopと、さらにN末端部分でJAKの活性中心に結合していると考えられる。がんで重要な働きをするチロシンキナーゼの阻害因子の分子機構が明らかにされた意義は大きい。CIS1はサイト力イン受容体に会合するがそれだけでSTAT5の活性化を抑制できるかどうか不明である。我々はフランスのグループとともにCIS1がユビキチン化されすみやかに分解を受けることを見い出した。チロシンりん酸化されたSTAT5もまたユビキチン化によって分解されることが知られており、CIS1が何らかの機構でSTAT5の分解を促進している可能性が考えられる。今後阻害の分子機構をより詳細に解明したい。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】09470036 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / エリスロポエチン / 胎児造血 / エリスポエチン / エリスロポエチン受容体 / シグナル伝達 / 細胞分化 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

赤血球造血の制御機構を解明するために我々は造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子の解析を行った。まず骨髄細胞をセルソーターにて造血幹細胞を分画し、この細胞集団からPCR増幅を経てcDNAライブラリーを作成した。これを酵母two-hybrid用のベクターに組み込み、c-kitをbaitとしたスクリーニングを行った。その結果STAP-1と呼ぶ新規遺伝子をクローニングした。この遺伝子はPleckstrin homology(PH)ドメイン,Src homology 2(SH2)ドメインを有するアダプター分子でc-kitによってチロシンりん酸化された。RT-PCRの結果、STAP-1の発現はc-kitを有する骨髄細胞に限局することが明らかとなった。また最も高い発現はCD34 low/-Sca-1+c-kit+Lin-の幹細胞分面に得られた。現在生化学的な解析を行っている。
次にエリスロポエチン受容体からのシグナルを制御する分子として、我々がクローニングしたCIS3の機能解析を行った。CIS3は胎児肝臓の赤芽球前駆細胞に強く発現していた。生理機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作成した。CIS3-/-ノックアウトは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5-15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】13,400千円 (直接経費: 13,400千円)