【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】11308026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目標は筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造をまずは、既に薄いながらもX線レベルの三次元結晶が得られていたカルシウム結合状態(ElCa^<2+>)の結晶を用いて、原子分解能で決定し、さらに他の生理的状態に関しても結晶化を進めることであった。本研究は我々の期待を上回る速度で進行し、3つの状態について原子モデルを構築でき、さらに他の2つのカルシウム結合状態(E1ATPとE1Pのアナログ)についても結晶化に成功している。この結果、カルシウムと燐酸の離脱に伴う構造変化を明らかにすることが出来た。すなわち、カルシウムの離脱に伴い10本ある膜貫通ヘリックスのうち、6本が大きな再配置を起こし、カルシウム結合時には大きく離れていた三つの細胞質ドメインはコンパクトに集合することが判明した。膜貫通ヘリックスのうち2本は、膜に対し垂直方向の運動成分を持ち、カルシウムの離脱・結合に伴って、ピストンのように運動すること、すなわちP型イオンポンプは原子サイズの手押しポンプのような機構を持っていることが明らかとなった。その成果の一部は2000年6月と2002年8月にNatureに、2002年12月にPNASに発表することが出来た。
以上の成果は世界的注目を集め、NatureやNature Structure BiologyのNew ＆ Views、ScienceのEditor's choiceで詳しく紹介された他、世界標準の生化学、分子生物学の教科書に最近の大きな成果として紹介されている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】31,110千円 (直接経費: 30,600千円、間接経費: 510千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】10044198 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 大量発現 / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目的はP型イオンポンプによる能動輸送のメカニズムを構造面から理解しようとするものであった。計画立案時には、結晶が小さく、電子顕微鏡による解析しか不可能であったが、X線結晶解析に適用しうる三次元結晶の作製に成功したため、将来の発展を考え、部位特異的変異体の構造解析のための準備に重点を置くことにした。そのため、アデノウイルスによる発現系を用いてカルシウムATPaseの大量生産に成功している、米国メリーランド大学イネシ教授との共同研究を中心に据えた。カルシウムATPaseは分子量11万の膜蛋白質であるため、同教授グループしか構造解析に必要な量の産生に成功しているグループはないからである。この目的のために、代表者が一度渡米、イネシ教授側が3度来日して、研究の打ち合わせを行った。特に問題となったのは、培養細胞からの抽出精製方法である。イネシ教授側の最初の来日時に、代表者が結晶化の為に改良してきた精製法を収得して貰い、培養細胞系に適用した。その結果、従来の色素カラムによる精製方法では、純度の点で不十分であることが判明したため、改良を検討している。また、カルシウム存在下の構造に関し高分解能でのX線結晶解析がほぼ終了したため、その結果をイネシ教授側が行ってきた、カルシウム結合に関与した部位特異的変異体を用いた実験結果の解釈に利用することが出来た。これらの実験は相補的であり、大変有意義な成果をもたらした。この結果は共同の論文として、現在投稿中である。また、この過程で、共同で総説を書くことが出来た(印刷中)。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】4,700千円 (直接経費: 4,700千円)