Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

テルペン / 生合成 / 遺伝子 / 酵素 / 環化 / 反応機構

当該代表者は、既知のテルペン合成酵素とはアミノ酸配列相同性を示さず、また既知の金属結合モチーフをもたない、生物活性物質Xの生産に関与する新しいテルペン合成酵素Yを発見した。そこで、本研究では、新たに発掘する酵素の機能解析を行うことで、これまで誰も入手し得なかったテルペン化合物の発見を目的とした。
初年度は、テルペン合成酵素Y（TC2）をコードする遺伝子を大腸菌で発現させて組換えタンパク質を得て、機能解析を行うことを目的とした。TC2遺伝子をクローニングしたプラスミドpET-28a(+)-TC2で大腸菌BL21(DE3)を形質転換して、TC2が可溶性画分として得られる培養条件を検討した。その結果、TB培地を用いた際、誘導剤であるIPTGが10 microMでわずかに発現、100 microMではTC2は大量に発現したが、ほとんど可溶画分には検出されなかった。さらに、Hisタグを用いて組換えTC2を精製するため、Ni-NTAレジンカラムで精製を試みたところ、可溶性酵素として0.3 mg程度得られた。次に、この精製した酵素に基質と考えられたGGDPとMg2+を加えてインキュベートし、反応産物を酢酸エチルで抽出、濃縮後、GC-MSで分析したところ、TC2を発現させた組換え麹菌で生産された生物活性物質Xと同一物質であることが判明した。以上の結果より、TC2が生物活性物質Xを生合成する酵素遺伝子であることを明らかにすることができた。これは、生物活性物質Xの生合成遺伝子を同定した初めての例として重要な知見である。
加えて、酵母であるPichia pastorisを用いたTC2の組換え酵素の取得も検討した。しかしながら、市販のPichia Expression Systemを購入してTC2の発現を試みたが、この系ではTC2の発現はまったく検出されなかった。

核酸 / 生合成 / 放線菌 / ヌクレオチド / 遺伝子 / 酵素 / 核酸系化合物 / 反応機構

本研究課題では、核酸系天然化合物の生合成酵素の精密機能解析を行い、得られた機能情報をもとに各種生合成酵素の理論的機能改変を行うことで新規な核酸系化合物を創出することを目的としている。2021年度ではまず、放線菌Streptomyces angustmyceticus NBRC 3934株の生産するangustmycin類の生合成機構の詳細を明らかにし、次いでこの生合成機構を改変することで、angustmycin誘導体の生産系の構築を行うことを目指した。それまでに、新規脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの鍵変換反応を担い、特異な構造であるexo-glycalを形成することを見出した。そこで、Agm6をコードする遺伝子の周辺を探索することにより、angutmycin Cの生合成に関与する遺伝子の機能解析を行った。その結果、agm1からagm6の6個の遺伝子によって生合成されることを、これら6個の遺伝子を異種放線菌であるStreptomyces albusに導入したところangutmycin Cとangustmycin Aの生産が確認されたことから結論づけることができた。また、Streptomyces decoyicusのゲノム配列にも、agm1からagm6の相同遺伝子が存在することも明らかにした。さらには、脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの変換反応を触媒する際に必要な補酵素はNAD+であり、NADP+は機能しないことも明らかにした。
本研究成果は、核酸系抗生物質angustmycinの生合成遺伝子を初めて同定し、その生合成経路を推定したものである。また、天然化合物としては稀なexo-glycal構造の形成機構を明らかにしたものとして重要である。これらの成果をまとめて、The Journal of Antibiotics誌で発表した。別の核酸系天然化合物であるA-94964の立体化学については、国際共著として発表することができた。

生合成 / 酵素 / 遺伝子 / 反応機構 / 物質生産

本研究では、メロテルペノイドの生合成マシナリーの精密機能解析と物質生産を主たる目的とした。漢方薬霊芝として利用される、担子菌Ganodermaに特徴的な、極めて新奇で複雑な骨格を有する生理活性メロテルペノイドの生合成研究に着手した。まず、生産菌のドラフトゲノム配列の解読により、候補となる生合成遺伝子クラスターを探索し、数種のP450酵素を含む生合成経路を確立と物質生産系の構築をめざした。現在継続進行中。
同時に、各種重要な生物活性を示す一連のインドールアルカロイドの生合成研究にも着手し、ハパインドール骨格構築の鍵となるプレニル転移酵素AmbP1, AmbP3のＸ線結晶構造解析にも取り組んだ。大腸菌に発現、精製した組み換え酵素の結晶構造解析により、２オングストロームの分解能で酵素立体構造の取得に成功した。関連酵素との構造の比較、立体構造に基づく部位特異的変異の導入などにより、活性部位を構成するアミノ酸残基を同定し、酵素反応機構、および、構造機能相関の解明に成功した。研究成果を印刷公表した。

合成生物学 / 生合成 / 酵素 / 遺伝子 / 物質生産 / 構造生物学 / 反応機構

複雑骨格天然有機化合物の生合成反応機構の解明と物質生産を目的とした。テレオシジンB、カリクリンＡ、アンチマイシン、メロテルペノイド、テルペノイド、インドールアルカロイド、ポリケタイドなど、各種複雑骨格天然物の生合成マシナリーの詳細や酵素反応機構の立体構造基盤の解明に成功し、一連の研究成果を印刷公表した。

【研究分担者】
淡川孝義	東京大学	大学院薬学系研究科(薬学部)	助教	(Kakenデータベース)
中村仁美	東京大学	大学院薬学系研究科(薬学部)	助教	(Kakenデータベース)
岡田正弘	東京大学	大学院薬学系研究科(薬学部)	准教授	(Kakenデータベース)
松田侑大	東京大学	大学院薬学系研究科(薬学部)	特任助教	(Kakenデータベース)
森貴裕	東京大学	大学院薬学系研究科(薬学部)	助教	(Kakenデータベース)

【研究連携者】
森田洋行	富山大学	和漢医薬学総合研究所	教授	(Kakenデータベース)
千田俊哉	大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構	物質構造科学研究所	教授	(Kakenデータベース)