Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

角膜移植 / 慢性炎症 / サイトカイン / バイオマーカー / 前房水 / 角膜内皮細胞 / 炎症 / 拒絶反応

主要な失明原因のひとつである角膜疾患は角膜移植で治療するが、他の臓器移植と同様に術後に移植片機能不全となり視力を失うことが少なくない。この原因のほとんどが角膜内皮細胞減少である。これまでの我々の臨床研究から、角膜内皮細胞減少の原因に虹彩と前房環境の病的変化があることを示した。我々の研究から、虹彩・前房水・角膜内皮・角膜実質・涙液と様々な組織を横断した相互作用と恒常性維持機構があり、角膜疾患、特に角膜移植の予後の悪い患者では、そのどれかが病的状態となり、周りの組織に悪影響をし、失明にいたることがわかってきた。今後は病的な前房水の変化をどのように診断し、どのように治療するかをさらに追及したい。

臓器移植 / 免疫抑制剤 / バイオマーカー / 拒絶反応 / プロテインチップ / 薬物動態・薬力学解析 / 低浸襲 / Non-invasive

臓器移植において、針生検に代わる、低侵襲、迅速、頻回にモニタリング可能、かつ信頼性の高い拒絶反応のバイオマーカーを開発することを目的に研究を行った。
常法によりラット異所性心移植モデルを作成した。急性拒絶モデル(ドナーにACIラット、レシピエントにLewisラット)および非拒絶モデル(ドナー、レシピエント共にLewisラット)において、術後3日目と4日目に採血と採尿を行い、プロテインチップTOF/MS装置(surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry;SELDI-TOF MS)解析により、タンパク質発現プロファイリングを行った。
非拒絶モデルと比較して急性拒絶モデルで発現が大きく変化するタンパク質を探索したところ、以下のような結果を得た。
血漿サンプル
1)陽イオン交換チップ:分子量電荷比(m/z)3,500、3,600、4,200、および6,500のタンパク質の発現が、拒絶反応により誘導された。一方、13,000のタンパク質は、拒絶反応により発現が抑制された。
2)陰イオン交換チップ:m/zが7,000、8,000、および9,000のタンパク質の発現が、拒絶反応により誘導された。一方、13,000のタンパク質は、拒絶反応により発現が抑制された。
3)金属(Cu)修飾チップ:m/zが9,000、11,500、および15,000のタンパク質の発現が、拒絶反応により誘導された。一方、7,000、18,000、および21,000のタンパク質は、拒絶反応により発現が抑制された。
尿サンプル
4)陰イオン交換チップ:m/zが3,300、4,400、および5,500のペプチドの発現が、拒絶反応により誘導された。一方、陽イオン交換チップからは、m/zが4,400、および29,000のペプチドおよびタンパクの発現が、拒絶反応により誘導された。金属(Cu)修飾チップからはバイオマーカー候補は見いだされなかった。
これらの分子量のタンパク質やペプチドは、低侵襲、迅速、頻回にモニタリング可能な急性拒絶のバイオマーカー候補と考えられる。

臓器移植 / 免疫抑制剤 / バイオマーカー / cDNAマイクロアレイ / ラット / 拒絶反応 / 薬物動態・薬力学解析 / PD analysis

針生検に代わる、低侵襲、迅速、頻回にモニタリング可能、かつ信頼性の高い拒絶反応のバイオマーカーを開発すると同時に、免疫抑制剤の治療効果を反映するバイオマーカーを開発することを目的に、以下の研究を行った。
1)ラット心移植および肝移植モデルにおいて血液中の遺伝子発現をcDNAマイクロアレイにて網羅的に解析し候補遺伝子の探索を行う
急性拒絶反応により発現が大きく誘導され、かつ免疫抑制剤シクロスポリンの投与によりその発現誘導が完全に抑制される10個の遺伝子を心移植および肝移植モデルにおいて発見した。さらに、薬力学的解析を行い、免疫抑制剤の血中濃度と発現量との間にも相関関係が見られた。これらの遺伝子は拒絶反応および免疫抑制剤の薬効のマーカーとして有用と考えられる。
2)遺伝子マーカーの治療学的有用性を臨床症例において明らかにする
慶應義塾大学病院の生体肝移植症例において、遺伝子マーカーが拒絶反応および免疫抑制剤の薬効のバイオマーカーとして有用かどうか評価した。急性拒絶を経験した3症例において、心移植モデルから得られた4種の遺伝子マーカーの末梢血液中発現量を定量的PCR法により測定したところ、移植後約1週間は低値に安定していたが、バイオプシーにより拒絶と診断される目より5日前後早い時期にこれらの遺伝子の発現は有意に上昇し始め、2〜3日前にはベースラインの2〜6倍程度高い発現を示した。また、従来臨床で用いられてきた肝機能検査値の上昇よりも早期にこれらの遺伝子の発現は上昇した。一方、肝移植モデルから得られた遺伝子マーカーの発現も急性拒絶を経験した生体肝移植症例において経時的に測定したところ、拒絶と診断される2日前にベースラインの10倍程度発現上昇することが確認された。
以上の結果から、これらの遺伝子は低侵襲、迅速、頻回にモニタリング可能な急性拒絶および免疫抑制剤の薬効のバイオマーカーとして有用と考えられ、国際特許出願を行うことができた(国際特許出願No.PCT/JP2005/009871、国際特許出願No.PCT/JP2006/300336)。

免疫抑制剤 / 心移植 / 肝移植 / 小腸移植 / バイオマーカー / DNAマイクロアレイ / プロテインチップ / 心臓移植モデル / 小腸移植モデル / 拒絶反応バイオマーカー / シクロスポリン / 網羅的解析 / 生体肝移植 / シクロスポリンA / CYP3A / 6β-水酸化コルチゾール / コルチゾール / 拒絶反応 / CYP3A5 / TaqMan PCR法

本研究の遂行により、(1)ラット心移植モデルを用いて拒絶反応および免疫抑制剤の薬効に関する遺伝子マーカーを見いだし、治療学的・薬理学的意義を明らかにした。(2)ラット肝移植モデルでも同様に遺伝子マーカーを見いだした。(3)ラット小腸移植モデルにおいては、早期拒絶マーカー候補タンパク質を同定した。
ラット心移植モデル:血液中の遺伝子発現をDNAマイクロアレイにて網羅的に解析した結果、拒絶群で発現が誘導される6種の遺伝子マーカー、IRF1、PSMB9、TAP1、CTSS、NOS2、PIM1を見いだした。さらに、シクロスポリンの用量-血中濃度-遺伝子発現量の関係を検討した。血中濃度と各遺伝子発現量との関係について薬力学的解析を行ったところ、両者の関係はシグモイドEmaxモデルにより良好に記述できることが明らかとなった。これらの遺伝子マーカーは免疫抑制剤の薬効マーカーとして有用と考えられる。
ラット肝移植モデル:血液中の遺伝子発現をDNAマイクロアレイにて網羅的に解析した結果、急性拒絶反応により発現が大きく誘導され、かつ免疫抑制剤シクロスポリンあるいはタクロリムスの投与によりその発現誘導が完全に抑制される4種の遺伝子を発見した。
ラット小腸移植モデル:プロテインチップを用いた網羅的検討の結果、ラット小腸移植モデルの急性拒絶時に上昇する3種類のバイオマーカー候補タンパク質、MRP(Migration-inhibitory-factor-related protein)-8(10.1kDa)、MRP-14(13.0kDa)、およびリゾチーム(14.8kDa)を検出した。リゾチームは免疫抑制剤投与により発現が抑制されていたことより、急性拒絶マーカーのみならず免疫抑制剤の薬効マーカーとなりうる。一方,MRP-8とMRP-14は拒絶の早期マーカーとなりうることが示唆された.

【研究分担者】
栗原俊英	慶應義塾大学	医学部	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
谷川原祐介	慶磨義塾大学	医学部	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
田辺稔	慶應義塾大学	医学部	講師	(Kakenデータベース)
谷川原祐介	慶應義塾大学	医学部	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
森田邦彦	慶應義塾大学	医学部	助教授	(Kakenデータベース)
島津元秀	慶應義塾大学	医学部	講師	(Kakenデータベース)
田辺稔	慶應義塾大学	医学部	講師	(Kakenデータベース)