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2021年度は、X染色体上の遺伝子領域について、クロマチン動態と遺伝子発現の関係に注目して研究を進めた。我々はこれまで、マウスX染色体特異的に存在する反復配列を見出し、この配列を標的とするgRNAと、蛍光タンパク質融合型dCas9(ヌクレアーゼ活性を欠損させたCas9)を発現させることで、X染色体上の遺伝子領域を可視化する系を構築している（Tjalsma S. et al. EMBO Rep 2021）。
本研究では、不活性X染色体をもつマウス胚性がん細胞MC12に、① Xist遺伝子近傍（3.5 kb下流）、② Dxz4遺伝子近傍、③ セントロメア近傍に対するgRNAと、ｄCas9-Haloを発現させて各遺伝子領域を生細胞内で可視化し、生細胞内動態（Mean square displacement: MSD）の計測を行った。gRNA/dCas9-Haloのシグナルは、それぞれの標的に対して細胞核内で2か所にfociとして観察され、同時に発現させたH3K27me3-mintbody（またはH4K20me1-mintbody）のシグナルと重なっているか否かにより、不活性X染色体上の遺伝子領域かどうかを判断した。約56ミリ秒間隔でgRNA/dCas9-Haloのタイムラプス観察を行い、fociの軌跡を解析することで、MSDを求め、時間間隔に対する変化をプロットした。フィッティングにより拡散係数と指数因子を求めたところ、3か所の遺伝子領域はいずれも不活性X染色体上では、動きがより拘束されていることが分かった。転写阻害薬triptolideを添加した場合は、不活性X染色体上のXist遺伝子近傍領域が動きやすくなったことから、Xist遺伝子の転写により動きが拘束されていることが示唆された。