Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

フォールディング / 分子動力学 / ミニ蛋白質 / マルチカノニカル / Trp-cage / chignolin / generalized Born

本年度は、20残基のミニ蛋白質Trp-cage(配列はNLYIQWLKDGGPSSGRPPPS)を研究対象として選定した。この蛋白質は水溶液中でTrp6を囲むかご状の構造をとる。4残基異なる変異体TC3b(配列はNLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)はこのかご状の構造をとる確率が低くなることが知られている。そこで、マルチカノニカル分子動力学シミュレーションを用いて野生型、変異体について自由エネルギー地形を計算し、立体構造形成能を比較した。この結果、天然構造からのCα原子のRMSDが2A以下となるポピュレーションは、野生型で56.9%であるのに対し、この変異体では12.1%と大きく減少していることが明らかとなった。この結果は、実験結果とよく一致しており、本研究で使用したシミュレーション手法が十分な信頼性を持っていることを示している。野生型とTC3bでは4つの残基が異なっていることから、どの残基が立体構造形成に重要な役割を果たしているかを明らかにするために、野生型にTC3bの残基を導入した変異体について、同様にシミュレーションを行った。現在までにTrp-cageのArg16をAlaに置換したR16A変異体について計算を終了した。この残基は野生型の天然構造においてAsp9と塩橋を形成していることから、TC3bの立体構造形成能が低い原因はこの塩橋が形成されないためとされてきた。しかし、野生型の天然構造からのCα RMSDが2A以下のポピュレーションは45.5%と、野生型に匹敵するレベルであった。従って、この塩橋の形成は、立体構造形成に必須ではないといえる。今後は他の残基についても同様に立体構造形成能への影響を精査し、立体構造形成における各残基の役割を明らかにしていく予定である。

フォールディング / 温度ジャンプ法 / 分子動力学 / スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ / α-ラクトアルブミン / カルシウム結合リゾチーム / アンフォールディング / 変性 / 蛋白質フォールディング / 分子動力学シミュレーション / 高圧 / スタフィロコッカルヌクレアーゼ / リゾチーム

蛋白質フォールディング機構解明を目指して、以下の二点に関する研究を行った。(1)球状蛋白質の巻き戻り速度過程をマイクロ秒からミリ秒の時間域で追跡することを目的として、高圧条件下でのジュール熱方式温度ジャンプ装置を開発、装置の性能を改良、検討した。(2)蛋白質のフォールディング過程の原子レベルでの記述を目的として、分子動力学法による高温下(400〜600K)でのアンフォールディング・シミュレーションを行い、既知の実験結果と比較した。
以下の成果が得られた。
(1)今回開発の高圧温度ジャンプ装置は、紫外部の光吸収スペクトルと蛍光スペクトルによる検出が可能であり、25℃で1,800気圧、-4℃で1,200気圧が達成された。-4℃、1,200気圧では、多くの球状蛋白質は低温変性状態にあるので、温度ジャンプ法によりマイクロ秒時間域のフォールディング反応を追跡することが可能となった。
(2)温度ジャンプ測定のモデル蛋白質として用いる予定で、プロリンを含まない疑似野生型スタフィロコッカル・ヌクレアーゼの巻き戻り反応を調べた。その結果、この蛋白質にはプロリンがないにもかかわらず、変性状態からの反応経路が複数に分岐した並行フォールディング経路が存在することがわかった。これは、蛋白質のフォールディングに並行経路が存在することを明確に示した最初の例である。
(3)ヤギαLAの組換え体が真性体よりも不安定であり、100倍近く速くアンフォールディングすることが実験的にわかっているが、今回、この実験結果を分子動力学によるアンフォールディングシミュレーションを用いて再現することができた。組換え体に付加しているN末端のメチオニン残基により、常温においてもN末端近傍の揺らぎが著しく大きくなることがわかった。

【研究分担者】
新井宗仁	東京大学	大学院・理学系研究科	助手	(Kakenデータベース)