【研究領域課題番号】20K10110 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

口腔がん / エピジェネティクス

【研究成果の概要】

口腔における発がんの素地の形成・病態に関与するオーラルマイクロバイオームの探索・同定を試みている。口腔内細菌と口腔がんの発症との関わりが捉えにくい理由として、喫煙や飲酒の発がんへの影響が非常に強いため、口腔内細菌の影響が見えにくくなっていることが一因と推測される。
本研究においては、口腔内細菌と喫煙や飲酒による影響を排除するため、対象患者を非喫煙かつ非飲酒の者に絞って解析・検討を行う。口腔がん患者ではがん同側の非がん歯肉の歯周ポケットから、健常者は臼歯部の歯周ポケットから口腔内細菌を採取することにした。研究申請者らを対象にして、口腔内細菌の採取、同定を試みている。ワッテなどで唾液を遮断し、綿球にて採取部位周辺のプラークを取り除き、滅菌済みのペーパーポイントを歯周ポケットに挿入し、歯周ポケット内の細菌の採取を試みた。しかしながら、ペーパーポイントを用いた採取法は、唾液の影響を受けない反面、十分な細菌量を採取できないことが多いため、解析に要する十分なrRNAを抽出することが困難であることがわかった。よって、現在は、採取方法を変更（安静時唾液の採取）し、解析に十分な細菌数、そして、かつ安定した細菌叢が得られるように試行錯誤を行っている。今後は、採取した細菌からrRNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いて口腔内細菌約４００種類 [歯周炎と強い関連があるRed ComplexやRed Complex以外の歯周病やう蝕に関連する菌種や全身疾患との関連が報告されている菌種の割合の測定を行う予定である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】17K11868 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

口腔がん / エピジェネティクス / 口腔粘膜 / DNAメチル化

【研究成果の概要】

口腔粘膜は食物や化学物質をはじめ多種多様な外的刺激に曝露されており、それによるジェネティックおよびエピジェネティック異常の蓄積が、口腔がんの素地を形成すると考えられている。本研究では、新規突然変異検出法を用いた口腔粘膜における発がんリスクを反映する稀少突然変異（ジェネティック異常）とDNAメチル化異常の蓄積（エピジェネティック異常）を探索・同定を試みた。

【研究の社会的意義】

最新の解析手法を用いて、がん化のリスクが高いと考えられる非がん口腔粘膜において、ジェネティックおよびエピジェネティック異常の同定を試みた。口腔がんの早期発見を可能にする異常の同定に成功すれば、口腔がんのリスクの高い人を見極めることが可能となり、がんの予防や早期発見に大きく貢献することが予測される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】24792176 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

口腔癌 / エピジェネティクス

【研究成果の概要】

非癌部食道粘膜における喫煙関連メチル化遺伝子(HOXA9, MT1M, NEFH, UCHL1)について、口腔扁平上皮癌組織における異常の有無の検討を行った。サンプルは口腔癌26検体および口腔白板症24検体を用いた。DNAメチル化解析法としては定量的Methylation-Specific PCR(MSP)法を用いた。完全メチル化DNAおよび完全非メチル化DNAを作成し、プライマーの条件検討に用いた。またPCR産物を組み込んだプラスミドDNAを、スタンダードDNAとして分子数の指標とした。正常粘膜組織、口腔白板症組織、口腔扁平上皮癌と段階的にメチル化レベルが上昇する傾向にあった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】22791955 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

臨床腫瘍学 / エピジェネティクス / 口腔癌 / 口腔前癌病変

【研究成果の概要】

MeDIP-CGI microarray法により口腔扁平上皮癌細胞株2系統(Ca9-22、HSC-2)においてプロモーター領域の高度DNAメチル化を有する遺伝子を324個同定した。また脱メチル化剤を用いた遺伝子発現回復網羅的解析より上記の口腔扁平上皮癌細胞株2系統において5-aza-dC投与後に3倍以上上昇している遺伝子を351個同定した。両解析の結果から、プロモーター領域のDNAメチル化により不活化されている遺伝子を125個抽出した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】21890061 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エピジェネティクス / 口腔癌 / 口腔前癌病変

【研究成果の概要】

【ゲノム網羅的DNAメチル化探索】
個別の症例の性質ではなく、複数の症例に関連したDNAメチル化の違いを同定するために口腔扁平上皮癌のDNA2サンプルについてゲノム網羅的なDNAメチル化検索を行った(Ushijima, T., Nat Rev, 2005)。口腔癌においては、ゲノム網羅的DNAメチル化解析の有力な手段である。ゲノム網羅的なDNAメチル化解析には細胞株を使用する方が感度が高いことが知られているため口腔扁平上皮癌細胞株2系統をJCRB細胞バンクより購入し解析に用いた。
【ゲノム網羅的DNAメチル化探索により得られたメチル化CpGアイランド】
口腔扁平上皮癌細胞株2系統でメチル化されていたCpGアイランドのフラグメントは約40,000個、そのうちプロモーター領域のものは1%程度であった。
【ゲノム網羅的DNAメチル化探索により得られたフラグメントのメチル化状態の確認】
ゲノム網羅的DNAメチル化探索により得られたフラグメントにおいて、口腔白板症粘膜上皮と口腔扁平上皮癌のDNAサンプル間で実際にメチル化の違いが存在するか否かを確認するためにMethylation-Specific PCR(MSP)法によるメチル化解析を行っている。MSP法ではメチル化DNA特異的プライマーおよび非メチル化DNA特異的プライマーを各々デザインした。メチル化解析に用いるDNAサンプルは制限酵素で断片化、Bisulfite(重亜硫酸ナトリウム)処理による塩基置換を行った後、精製し、解析に用いる。一回のBisulfite処理には、信頼できる結果を得るために各々最低500ngのDNAを用いた。今後、メチル化の違いが確認できたフラグメントに関してBisulfite-sequencing法を用いて各々のCpGサイトがどのようにメチル化されているか詳細に検討する予定である。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)