Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

翻訳速度 / コドン / mRNA / tRNA / リボソーム

翻訳 / リボソーム / 履歴 / 選択的スプライシング / mRNA / 相互作用解析 / 発現制御 / 構成的生物学 / バイオテクノロジー / トランスレイトーム

真核生物のもっとも基本的なモデル生物である出芽酵母を用いて、タンパク質合成装置であるリボソームを細胞内で標識し、標識されたリボソームを生理条件下で抽出するための技術基盤を構築した。また、細胞内で同じ配列の違う分子を見分けるための方法や、間接的あるいは一過的なmRNA とタンパク質の相互作用を解析するための方法につながるシード技術を開発した。さらに、予期せずして新奇な翻訳開始現象を見出した。

生命現象の根源とも言える「タンパク質合成反応」に従来とは異なる視点から挑むことを通じて生命の不思議に対してより深い理解をもたらすと期待される。長期的には、「転写量からタンパク質合成量の精密な予測」を実現し、発生・分化の仕組みや病因・病態の解明など生命科学のあらゆる分野において、生命現象を動的なシステムとして理解すること、さらにその挙動を計算機上で再現することに貢献すると期待される。

リボソーム / 品質管理 / 新生鎖 / mRNA / 新生ペプチド鎖

mRNA上に連続したレアコドンや連続した塩基性アミノ酸配列などが出現するとリボソームによる翻訳伸長反応が停滞する。細胞はこの翻訳停滞を異常な翻訳と認識し、その異常mRNAに由来する新生ペプチド鎖の特異的分解機構(RQC; Ribosome associated quality conyrol)を誘導する。新生ペプチド鎖の分解機構であるRQC機構は、E3ユビキチンライゲースであるRqt1に依存しており、リボソームタンパク質であるS20の特異的ユビキチン化によって誘導される。本課題では、ユビキチン結合タンパク質を含む新規複合体(RQT複合体)の機能解析を行った。

翻訳系 / タンパク質生合成 / tRNA / アシルtRNA 合成酵素 / アシル化AMP / リボソーム / EF-Tu / 化学的ミスアシル化AMP / タンパク生合成 / アシルtRNA合成酵素 / mRNA / 遺伝コード / センスコドン / ノンセンスコドン / タンパク翻訳系 / アミノアシルtRNA合成酵素 / アミノ酸 / 非天然アミノ酸 / ヒドロキシカルボン酸 / 終止コドン / ペプチドライブラリー

非天然基質のタンパク質への導入に関し、リボソームを利用した主鎖伸張型(高)分子合成について検討し、タンパク質のリボソーム合成において適用できる非天然基質としてβ-ヒドロキシ酸が有効な基質になりえることを明らかにした。また、基質についての選択性がEF-Tu との相互作用の強さにあることを解明した。非天然基礎質のタンパク質への導入手法については化学的ミスアシル化AMP 法を開発し、非天然タンパク質の酵素合成に道を拓いた。

リボソーム / ディスプレー / 蛋白質 / 相互作用 / 細胞 / 活性 / mRNA / 解析 / 試験管内進化 / 網羅的 / 非翻訳領域 / tRNA / 探索

天然型mRNAを荷札として用い、かつ、全長蛋白質を提示できる改良型リボソームディスプレー法の開発を目標とする。具体的には、終止コドンを読み飛ばし、その後に続く非翻訳領域をリンカーとして利用可能な改変翻訳系の構築を目指した。昨年度においては原核系翻訳システムにおけるコンセプトレベルでの具現化を実施、RNAの安定性、リボソームディスプレー後のRNA回収率から再構成蛋白質翻訳系を用いた改変翻訳系の構築を検討した。また、3種の終止コドンを効率的に読み飛ばすことが可能なサプレッサーtRNAの探索を行ない、サプレッション効率、また、3種の終止コドンに対する適応性の点からtRNAserを基本とする3種サプレッサーが本系の目的を満たすことを見出している(サプレッション効率向上のため、Release Factor非含有翻訳システムを利用した)。また、天然型と同じ配列の(かつ、様々な長さの)3'側非翻訳領域を有する擬似天然型Dihydrofolate Reductase mRNAを人工的に準備し、作成した改変翻訳系でのリボソームディスプレーを実施した。終始コドンより3末端側にT7-tagを組み込んでおいたところ、T7抗体によるタグ釣り上げが可能であり、この結果より、本系において終始コドンの読み飛ばし、3'-UTRのリンカーとしての利用が可能であることが示された。また、DHFRの配列を標的とする抗体を用いた実験も実施した。併せて、終結因子を取り除いた非再構成型タンパク質翻訳システムの調整を目的とし、RF1に対するRNAアプタマーを取得、サプレッション効率を上昇させる系の構築にも成功した。

【研究協力者】
堀江史博
本山志織
都竹亜紀子
中田絵理子

【研究分担者】
山東信介	京都大学	大学院・工学研究科	助教	(Kakenデータベース)