Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

Rhizopus / キチナーゼ / 稲 / 芝 / トマト

本研究は接合菌類の糸状菌Rhizopus oligosporusの自己溶菌にかかわるキチナーゼ遺伝子を実用植物に組込み発現させることによって有害糸状菌耐性植物の作出を試みたもので植物としてはタバコ、芝、トマト、稲、リンゴなどを計画した。まず我々のグループでその遺伝子を単離した糸状菌R.oligosporusのキチナーゼI遺伝子(chi1)からイントロンとC末端側のプロ配列をコードする部分を除き、カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーターとノパリン合成酵素遺伝子のタ-ミネーターの間に挟み込んだものをバイナリーベクター系を用いてタバコに導入した。これらを植物体に再生させ自家受粉後植物体に成長させた。ウェスタン解析の結果、目的の蛋白質が生産され、細胞抽出液中のキチナーゼ活性も親株に比べて3-5倍高くなっていることが明らかになった。これらの植物の葉に対して病原性菌類であるSclerotinia sclerotiorum、Botrytis cirereaを接種した結果、親株では菌を接種したディスクの回りに大きな病兆が見られたのに対しキチナーゼ遺伝子導入株においてはほとんどそのような症状は見られなかった。一方、稲についてはトウモロコシのユビキチン遺伝子プロモーターとノパリン合成酵素遺伝子のタ-ミネーターの間にchi1遺伝子を挟んだものをパーティクルガン法を用いて稲に導入した。得られた形質転換体について細胞内でchi1遺伝子産物を生産している株をウエスタン解析により選抜した。これらの株を完全な植物体まで再生させ、イモチ病菌を噴霧接種してその効果について検討したところ、イモチ病菌に耐性化を示す株の数が明らかに増加していた。トマト、リンゴ、芝の系においても現在これらの遺伝子を導入したカルスを植物体に再生させることを試みている。

糸状菌 / アスパルティックプロテイナーゼ / キチナーゼ / プロ配列 / Rhizopus / フォールディング / 分泌 / aspartic proteinase / molecular chaperone / S.cerevisiae / pro-sequence / secretion / Rhizopus niveus

Rhizopus niveus aspartic proteinase-I(RNAP-I)のプロ配列の機能をin vitroで検討するために、プロ配列の切断されていないproRNAP-Iと成熟型RNAP-Iについて、それぞれin vitroで変性させ緩衝液中で再生を起こさせた結果、proRNAP-Iは緩衝液中75%程度まで活性が回復するのに対し、成熟型RNAP-Iは全く活性の回復は見られなかった。またRNAP-Iのプロ配列だけを精製し成熟型RNAP-Iの再生系にトランスに加えた場合、野性型のプロ配列をトランスに効かせた場合は70%程度まで活性が回復した。このことからプロ配列がシャペロンとしての機能を有していることが明らかになった。また、プロ配列に変異が入ったためにS.cerevisiaeで分泌されなくなったRNAP-I改変体について間接蛍光抗体法、細胞分画法、sec変異株を用いて解析を行った結果、これらは小胞体内で分解されていることが明らかとなった。一方、R.oligosporusが菌体外に分泌するキチナーゼ1についてそのC末端にあるプロ配列を除いた改変体遺伝子と野生型遺伝子をS.cerevisiae中で発現させその分泌について検討を加えた結果、キチナーゼ1はプロ配列のない状態でも効率良く分泌されることが明らかになった。またプロ型キチナーゼ1は活性がほとんど見られなかった。さらにR.oligosporusについてパルスラベル、細胞分画法を用いて検討したところ、キチナーゼ1はプロ型のままR.oligosporusの細胞壁まで輸送され自己溶菌に際してプロ配列が切断されることが推定された。またRNAP-I、キチナーゼ1のプロ配列の機能をRhizopus中で検討するためにるためにR.delemarの形質転換系の検討、改良を行いR.delemar内で異種遺伝子を発現させる系を確立した。

【研究分担者】
寺川輝彦	北興化学(株)	開発研究所	研究員
小池勝	北興化学(株)	開発研究所	主任研究員
原田聰	カゴメ(株)	総合研究所	研究員
田中宥司	カゴメ(株)	総合研究所	主任研究員
堀内裕之	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助手	(Kakenデータベース)
原田聡	カゴメ(株)	総合研究所	研究員

【研究分担者】
堀内裕之	東京大学	農学部	助手	(Kakenデータベース)