Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

１分子計測（SMD） / ナノバイオ / 磁気ピンセット / 新生鎖 / ストレス応答 / １分子計測 / 温度生物学 / 翻訳アレスト / 光ピンセット / １分子計測（SMD)

翻訳制御に関する研究を行い、以下の成果を得た。（1）蛍光標識したpre-miRNAを培養細胞にインジェクションし、miRNAの動態を蛍光相関分光法と１分子イメージング法で解析した。１分子のmiRNAが細胞骨格に沿って運動する様子が観察された。（2）SecM、mRNA、リボソームからなる翻訳アレスト複合体をカバーガラスと磁気ビーズに結合させ、負荷を加えた。その結果、負荷依存的に翻訳アレストが解除されることを明らかにした。（3）ストレス顆粒内のmRNAを蛍光標識して超解像顕微鏡観察した。ストレス顆粒内にはmRNAが高密度で存在している領域と低密度で存在している領域があることを発見した。

DNA に蓄えられた遺伝情報は一時的にmRNA にコピーされ、リボソームによってタンパク質に翻訳される。翻訳の制御は、生命活動の根幹に関わる重要なプロセスであり、その制御機構を分子レベルで理解する必要がある。本研究は、新たな遺伝子発現制御機構として注目されているRISCの形成機構、ストレス顆粒の形成と維持機構、翻訳アレストの分子機構について新たな知見を得ることに成功しており学術的な意義がある。

光ピンセット / リボソーム / 翻訳開始 / 翻訳アレスト

本申請研究では、翻訳過程のうち「開始段階」と「アレスト段階」に着目し、その素過程において1分子力学解析を行うことを目的としている。以下に、本年度の成果を示す。
(1)翻訳開始段階の1分子力学解析
30Sサブユニット-mRNA複合体に開始tRNA、開始因子2(IF2)、50Sサブユニットを加えて、30Sサブユニット-mRNA間の破断力測定を行った。30Sサブユニット-mRNA複合体に開始tRNAを添加すると、破断力が増大することを見出した。また、30Sサブユニット-mRNA-開始tRNA複合体にIF2と50Sサブユニットを共存させると、さらに破断力が増大することが分かった。先行研究により、開始tRNAの結合に伴ってmRNAのコンフォメーションが変化すること、50Sサブユニットの結合およびIF2のGTP加水分解によりリボソームの構造やIF2の結合位置が変化することが報告されている。このようなリボソーム-翻訳因子複合体のダイナミックな変化が30Sサブユニット-mRNA間相互作用を安定化し、効率的な翻訳開始を可能にしていると予想される。現在この仮説を検証すべく、コントロール実験を含めて様々な確認を行っている。
(2)翻訳アレスト段階の1分子力学解析
C末端にSecMのアレスト配列を有するHaloTagおよびSNAP-tagタンパク質を組換え発現させるコンストラクトを作成した。解離因子を除いた無細胞タンパク質翻訳系を用いることで、翻訳がアレストしたリボソーム-タグタンパク質複合体が安定に調製できることが分かった。また、リガンドを介してタグタンパク質をガラス基板上に固定することで、リボソーム-タグタンパク質複合体が効率よく基板固定できるようになった。現在までに数例、リボソーム-SecMアレスト配列間相互作用の破断が観察できている。